葡萄糖异构酶突变体制造技术

本发明专利技术披露利用基因突变技术改良的一系列耐热高催化活性Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ葡萄糖异构酶突变体。这些葡萄糖异构酶突变体可用于直接产生果糖含量等于或高于５５重量％的果葡糖浆，或用于产生果糖含量低于５５重量％的果葡糖浆。

【技术实现步骤摘要】

-本专利技术涉及分子生物学与生物
，具体地说，涉及利用基因突变技术制备高活 力、或高活力并耐热的葡萄糖异构酶突变体的方法、所获得的突变体及其应用。
技术介绍
葡萄糖异构酶(Glucose isomerase， E.C.5.3丄5， 简称GI)、或称木糖异构酶(Xylose isomerase)是戊糖发酵途径的关键酶。该酶是最重要的酶制剂之一(Kaneko， W a/.， 所^d 别o化c^oZ说oc/2em， 64:940-947， 2000)。食品工业使用该酶制备果葡糖浆。酶法生产果葡糖浆，产品中果糖的含量取决于反应的温度。温度越高，异构反应越趋 向于果糖的生成。目前商用葡萄糖异构酶主要取自密苏里游动放线菌(J"/"印/朋^ 7w^owr/em7.力、凑菱结芽孢杆菌^gflcz.〃船ccwgw/am")、或链霉菌(5^e; to附少c^)。这些葡萄糖异构 酶在高温(如高于65。C)下稳定性差。因此，目前工业上在60。C左右制备果葡糖浆，产物中果 糖的含量也就较低， 一般不超过44%。含更高浓度果糖的果葡糖浆通常依赖层析分离方法生 产，由此增加了生产成本。世界各地的科，家对从耐热菌中筛选并通过蛋白质工程的方法培育耐热、高催化活性的 葡萄糖异构酶进行了许多研究。如J.G. Zeikus及其合作者从777em70cmaera&c^^m racctora(^cwm、 7Tzwwotoga "eapo/fto""等数种耐高温菌中分离并研究了耐高温葡萄糖异构 酷(见Lee W a/.， Jow7 a/ Gem^a/ Af/cro6/o/ogy， 139:1227-1234， 1993; Vieille ef a/.， A/W/zocfe i 拜附o/ogy， 330:215-24, 2001; Lee ef Jowma/o/Gewera/Mz.cra6z'o/ogy， 139:1241-1243， 1993; Scriprapundh a/.， /Vofe/"五"g7'wee〃.wg， 13:259-265， 2000; Scriprapundh " a/.， /VoW"16:683-690， 2003; Zeikus " a/. ， US Patent NO 5,656,497)。这些或 其它来源的耐高温葡萄糖异构酶之耐热性能均不如人意，且活力较低，尚未见用于工业化生 产。因此，目前仍存在高活力、或高活力并耐热的葡萄糖异构酶的需求。
技术实现思路
本专利技术利用遗传工程和蛋白质工程技术对来源于i: racc/wra/j^c"m的葡萄糖异构酶进 行改良，获得了一系列高催化活性的葡萄糖异构酶突变体，适宜生产含高果糖的果葡糖浆。本专利技术的目的在于提供高催化活性的葡萄糖异构酶突变体。本专利技术的目的还在于提供使 用本专利技术所述的葡萄糖异构酶突变体直接生产果糖含量等于或高于55%的果葡糖浆。本专利技术 的目的还在于提供使用本专利技术所述的葡萄糖异构酶突变体生产果糖含量低于55%的果葡糖 浆。为实现本专利技术的上述目的，本专利技术人进行了大量深入的实验，通过对7: .racc/rara/卢/cwm 葡萄糖异构酶基因进行定点突变，随后在MacConkey培养基上筛选，从而取得一系列高催化 活性、或具高催化活性并耐热的葡萄糖异构酶突变体。具体而言，利用本领域己知的技术， 构建含有亲本葡萄糖异构酶基因的载体质粒，然后设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸 种类，再合成适当的引物，以所述的含亲本葡萄糖异构酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增 DNA片段、装配所扩增的DNA片段以及PCR扩增全长突变基因。通过将该全长突变基因克 隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有葡萄糖异构酶活性的阳性克隆。 最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变。在本专利技术制备葡萄糖异构酶突变体的方法中，可采用任何适当的载体。例如，适用的载 体包括但不限十原核表达载体pGEMT-Easy， pRSET和pET21;包括但不限于真核表达载 体pYDl禾QpYES2/GS;包括但不限于克隆载体pUC18A9禾口 pBluscript-SK。在本专利技术制备葡萄糖异构酶突变体的方法中，所获得的葡萄糖异构酶突变体基因可以在 原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或 真核细胞胞外表达。在本专利技术制备葡萄糖异构酶突变体的方法中，所述载体的微生物宿主细胞为原核细胞或 真核细胞。所述原核微生物包括但不限于大肠杆菌.凝结芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌、巨大芽 胞杆菌(如巨大芽胞杆菌BP931)、 Z ^cc/7o尸o(v'rtr"m和链霉菌(如Sreptowyces' c^w似"cw M1033)。所述真核微生物包括但不限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母(如毕赤巴斯德酵母 GS115/9891)。本专利技术获得了一种葡萄糖异构酶突变体,其特征在于以序列表中序列2所示氨基酸序列 为参考序列,至少存在一个氨基酸的差异,并且以D-葡萄糖为底物其具有比亲本至少高山 50-150%、优选至少高出150-250%、更优选至少高出250%的葡萄糖异构酶催化活性。优选 的是，以序列表中的序列2为参考序列，具有至少一个选自第139位的色氨酸到其他19个天 然氨基酸、第182位的精氨酸到其他19个天然氨基酸、第187位的苯丙氨酸到其他19个天 然氨基酸和第299位的苏氨酸到其他19个天然氨基酸的突变,并且以D-葡萄糖为底物其具有 比亲本高出至少50%的葡萄糖异构酶催化活性。更优选所述第139位的色氨酸突变为赖氨酸 (Lys)、或丝氨酸(Ser)、或半胱氨酸(Cys)、或异亮氨酸(Ile)、或苏氨酸(Thr)、或天冬酰胺(Asn)、 或苯丙氨酸(Phe);所述第182位的精氨酸突变为脯氨酸(Pro)、或丝氨酸(Ser)、或丙氨酸(Ala)、 或异亮氨酸(Ile)、或苏氨酸(Thr)、或缬氨酸(Val);所述第187位的苯丙氨酸突变为甘氨酸(Gly)、 或丝氨酸(Ser)、或丙氨酸(Ala)、或脯氨酸(Pra);和/或所述第299位的苏氨酸突变为异亮氨酸 (Ile)、或酪氨酸(Tyr)、或半胱氨酸(Cys)、或蛋氨酸(Met)、或谷氨酸(Glu)、或谷氨酰胺(Gln)。 最优选的是，木专利技术的葡萄糖异构酶突变体包含下文表2中所列的那些突变的氨基酸序列3这些突变体具有高的催化活性、并耐热和对较低pH具有耐受性。例如，在本专利技术获得 的一系列突变体中， 一个具有四个点突变的突变体MGI-4的比活性较亲本高651%,且在80°C 反应24小时后仍保持50%或以上的活力，且在pH5.0处的活性相当于其在最佳pH (pll 7.0) 时的活性的80%。另一个具有三个点突变的突变体MGI-3的比活性较亲本高412%，且在80°C 反应16小时后仍保持50%或以上的活力，且在pH5.0处的活性相当于其在最佳pH (pH 7.0) 时的活性的70%。本专利技术获得的高催化活性或高催化活性并耐热的葡萄糖异构酶突变体可用于直接生产 果糖含量等于或高于55%的果葡糖浆，或用于生产果糖含量低于55%的果葡糖浆。所述的葡 萄糖异构酶突变体可以以未经纯化粗酶形式使用，也可以是经部本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖异构酶突变体，其特征在于以序列表中的序列２为参考序列，具有在第１３９位的单突变，并且以Ｄ－葡萄糖为底物其具有比亲本高出至少５０％的葡萄糖异构酶催化活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：王骏，傅荣昭，沈冬，金彩科，刘兆明，陈军明，
申请(专利权)人：百瑞全球有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]