Ｌ－莱果酸高产突变株曲霉Ｎ１－１４’及生产Ｌ－苹果酸的方法技术

Ｌ－苹果酸高产突变株曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. ）Ｎ１－１４′及利用该菌株生产Ｌ－苹果酸的方法，本发明专利技术涉及工业微生物及其利用。本发明专利技术提供的曲霉Ｎ１－１４′ＣＣＴＣＣＭ９４１０３能够直接发酵糖质原料产生Ｌ－苹果酸，该产酸菌株在２０ｍ↑［３］罐上，发酵糖质原料１００－１２０小时，产酸７５－８５ｇ／ｌ，产酸速率０. ６５－０. ７１ｇ／ｌ. ｈ，对糖转化率６５－６８％。本发明专利技术还提供了一套包括发酵过程和Ｌ－苹果酸提取过程的可行的工业化工艺流程，其工艺流程合理，简化，产品中Ｌ－苹果酸含量≥９９×１００↑［－２］，其突出特点是富马酸含量极低，小于０. ２×１０↑［－２］。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可直接发酵糖质原料生产L-苹果酸的微生物菌株及利用该菌株生产L-苹果酸的方法。L-苹果酸学名为L-羟基丁二酸(L-hydroxysuccinic acid)，是继柠檬酸之后的一个很有发展前景的产品，可广泛应用于食品、医药、印染、化工、电镀及建筑材料等各个方面。迄今为止，制造L-苹果酸的途径大致有5条1，从植物茎叶及果实中提取;2、拆分化学合成的DL-苹果酸;3、利用微生物产生的富马酸酶转化富马酸为L-苹果酸(简称酶法);4、利用微生物发酵糖质原料生产L-苹果酸;5、利用微生物发酵非糖质原料生产L-苹果酸。目前，国内外市场的L-苹果酸产品主要采用酶法生产，然而由于化学合成的高纯度富马酸价格较高，加上产品中的富马酸含量较高等因素，很多国家一直在探讨和发展直接发酵糖质原料生产L-苹果酸的方法。1990年以色列人Battat等，采用黄曲霉(Aspergillus flavus)在16L发酵罐上发酵葡萄糖约192小时，产酸113g/L，产酸速率0.59g/L.h，但该菌种产生黄曲霉毒素，因此不能应用于生产(Biotechnology and Bioengineering 37∶1108～1116)。1991年日本公开特许公报(平3-180187)公布了采用稗疣黑粉菌(Ustilago crus-galli)等摇瓶发酵葡萄糖168小时，产酸52g/L，产酸速率0.31g/L.h的结果。1988年中国无锡轻工业学院金其荣等(食品科学2∶12-19)报告了采用不产黄曲霉毒素的黄曲霉摇瓶发酵大米水解糖140小时，产酸60-70g/L，产酸速率0.43-0.50g/L.h，500L规模中试平均产酸44g/L的结果。上述L-苹果酸产生菌的产酸水平及其发酵工艺技术均未达到工业化生产的水平。本专利技术的目的是提供一种能直接发酵糖质原料生产L-苹果酸，产酸速率及对糖转化率高，可进行工业化生产L-苹果酸的微生物菌株以及利用该微生物菌株生产L-苹果酸的可行的工业化生产方法。本专利技术所提供的微生物菌株是经选育的L-苹果酸高产突变株曲霉(Aspergillus SP.)N1-14′，该曲霉N1-14′的样品保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为M94013。该菌株以下简称为N1-14′CCTCC M94013。N1-14′CCTCC M94013在察氏(Czapek)培养基上，28-32℃下培养5-7天，其菌落直径约1-2cm。在生长初期，菌落浅黄白色，老后呈淡褐黄色，较致密，没有特殊气味，反面淡黄色，具较明显的皱褶。菌丝短羊毛状，白色，有隔;分生孢子梗从壁厚而膨大的足细胞垂直长出，无隔，上部较粗大，顶端膨大成近球形的泡囊，从泡囊的全部表面放射状地生出小梗，小梗单层或双层，分生孢子生于小梗顶端，最初为椭圆形或洋梨形，成熟后为球形或近球形，带黄褐色和粗糙的小刺，并具有不很明显的双层壁。N1-14′CCTCC M94013的生长适宜条件为1、培养物质20×10-2马铃薯汁500-1000ml/L，葡萄糖10-30g/L，KH2PO42-5g/L，MgSO4·7H2O 1-3g/L，琼脂15-20g/L;2、培养温度25-35℃;3、培养pH值5.5-7.5。本突变株经测定不产生黄曲霉毒素，其全发酵液急性中毒试验属实际无毒级，慢性蓄积试验属弱蓄积。利用N1-14′CCTCC M94013直接发酵糖质原料可生产L-苹果酸，本专利技术在摇瓶试验的基础上，通过1.2L，20L，240L，1.7m3及20m3发酵罐的逐步扩大试验，已经形成了利用N1-14′CCTCC M94013直接发酵糖质原料生产L-苹果酸的合适发酵工艺条件，并建立了从发酵液中提取L-苹果酸的可行方法。本专利技术所提供的生产L-苹果酸的方法，其主要特点是利用N1-14′CCTCC M94013对糖质原料进行直接发酵。所说的糖质原料可为葡萄糖，淀粉水解糖，蔗糖及淀粉等，如采用淀粉为原料，则需加α-淀粉酶进行液化处理。利用N1-14′CCTCC M94013直接发酵糖质原料生产L-苹果酸的工艺过程包括1、发酵工艺过程1.1、在25-35℃温度范围并加入其主要成份为葡萄糖和KH2PO4的产孢促进剂的条件下，使N1-14′CCTCC M94013在三角瓶麸皮培养基内大量产生孢子，即菌种制备;1.2、将成熟的孢子接入种子罐中含有碳酸钙的培养基进行种子培养;1.3、将成熟的种子移入繁殖罐中含有碳酸钙的培养基中进行深层液体孢子生产;1.4、将合适菌龄的种子及成熟的孢子移入发酵罐中含有碳酸钙的培养基中，对糖质原料进行直接发酵得到发酵醪;2、L-苹果酸提取工艺过程2.1、直接真空抽滤发酵醪收得含有菌体的L-苹果酸钙;2.2、用无砷硫酸解含有菌体的L-苹果酸钙，并对酸解液进行除杂和脱色;2.3、对上述除杂脱色后的酸解液真空抽滤去除菌体和硫酸钙，获得L-苹果酸粗溶液;2.4、在L-苹果酸粗溶液中加入絮凝剂澄清后精滤，然后使精滤液通过阴阳离子交换树脂进行净化;2.5、将净化后的L-苹果酸溶液进行浓缩、结晶，最后将离心收得的湿晶体进行干燥。本专利技术在菌种制备阶段采用产孢促进剂，可以极大地提高孢子产量，一般可使麸皮培养基产生孢子由1.0×106/克培养基(干重)提高到4.0×108/克培养基(干重)，产孢促进剂的主要成份为葡萄糖与KH2PO4，两者的比例为葡萄糖KH2PO4＝1∶0.005-0.05(重量份)。所使用的麸皮培养基成份(按每公斤培养基所含克重g/kg计算)为新鲜麸皮400-600，余量为水。加入培养基中的产孢促进剂的用量为麸皮培养基的(1-10)×10-2，而以(3-6)×10-2为佳。N1-14′CCTCC M94013适宜的产孢温度范围为25-35℃，较好的产孢温度范围为28-32℃。本专利技术采用的深层液体孢子生产步骤(步骤1.3)目的是进一步解决真菌发酵的孢子产量问题，可以使液体中孢子产量达到5.0×105个/毫升。适宜的种子培养及深层液体孢子生产步骤所用的培养基成份(按每升培养基所含克重g/L计算)为还原糖30-70，(NH4)2SO41.0-5.0，KH2PO40.1-1.0，MgSO4·7H2O 0.2-1.2，MnSO4·H2O 0.2-1.2，FeSO4·7H2O 0.3-1.5，CaCO320-60。自然pH，其中(NH4)SO4分开灭菌。在步骤1.4中，适宜的发酵产酸的培养基成份(按每升培养基所含克重g/L计算)为还原糖115-135，(NH4)2SO41.0-5.0，KH2PO40.1-1.0，MgSO4·7H2O 0.2-1.2，MnSO4·H2O 0.2-1.2，FeSO4·7H2O 0.3-1.5，CaCO370-120。自然pH，其中(NH4)2SO4分开灭菌。本专利技术用以澄清L-苹果酸粗溶液的絮凝剂(步骤2.4)主要采用聚丙烯酰胺，其用量为1-30mg/L(L-苹果酸粗溶液)，最佳用量为5-10mg/L(L-苹果酸粗溶液)。用以净化L-苹果酸溶液的阴离子交换树脂(步骤2.4)可采用F-1柠檬酸阴离子交换树脂，也可采用A561阴离子交换树脂。阳离子交换脂可采用732阳离子交换树脂或C26阳离子交换树脂。利用N1-14′CCTCC M94本文档来自技高网...

【技术保护点】
Ｌ－苹果酸高产突变株曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｎ１－１４′），其特征在于该突变株是其样品保藏于中国典型培养物保藏中心（ＣＣＴＣＣ），编号为Ｍ９４０１３这样的微生物菌株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴清平，周小燕，陈素云，钟瑜，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]