烟草14‑3‑3c基因的植物表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种烟草

14 3 tobacco plant expression vectors of 3C gene and its application

The invention discloses a kind of tobacco

【技术实现步骤摘要】
烟草14-3-3c基因的植物表达载体及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及烟草14-3-3c基因植物表达载体及其在制备吸收甲醛能力增强的转基因植物中的应用。
技术介绍
甲醛(Formaldehyde,HCHO)被世界卫生组织列为具有致癌性的挥发性有机化合物(volatileorganiccompounds,VOCs)，它能够以气态、溶解态或结合态的形式存在于生物的体内或外环境中。水体中甲醛污染来自于化工和医药等行业在生产过程中产生的大量HCHO废水，如酚醛树脂的连续生产过程中产生的冷凝水和冲泵水中都含有高浓度的HCHO，在《GB31571-2015石油化学工业污染物排放标准》中规定，废水的甲醛排放限值为1mg·L-1，《GB8978-1996污水综合排放标准》规定第二类污水允许的最高甲醛排放浓度为2mg·L-1，《GB3838-2002地表水环境质量标准》则规定，集中式生活饮用水地表水源地的甲醛含量不得高于0.9mg·L-1。此外，生物和医学领域用于标本防腐处理的甲醛溶液废水也是水体HCHO污染的来源。甲醛对人体有多方面的毒害作用且与人的许多疾病有一定相关性，它对皮肤、黏膜、肝脏、生殖系统以及神经系统等都表现出显著的毒害作用。外源性甲醛通过吸入或皮肤黏膜接触的方式进入人体，首先对皮肤和黏膜有一定刺激性和致敏性，低浓度液体甲醛会引起DNA断裂，高浓度的液体甲醛会明显引发DNA与蛋白质的交联作用。14-3-3蛋白是真核生物细胞中一组高度保守的酸性二聚体蛋白质，最早在牛脑组织中被发现，二十多年后才相继从多种植物中被分离出来。植物中14-3-3蛋白已被证实广泛分布于细胞质、细胞核、线粒体基质、叶绿体基质和类囊体膜上。14-3-3蛋白为同源或异源二聚体，每个单体含有9个α-螺旋，两个反向平行的单体在空间上形成一个沟槽状结构，是靶蛋白的结合区，14-3-3蛋白通过与靶蛋白结合从而调节各种生命活动，N-末端和C-末端是14-3-3蛋白行使其功能的重要结构，不同14-3-3蛋白的N-末端、C-末端是高度变化的，N-末端在14-3-3蛋白二聚体的形成以及与靶蛋白结合中发挥着重要作用，C-末端则直接参与蛋白质-蛋白质间相互作用。14-3-3蛋白是植物细胞内蛋白质间相互作用的核心，广泛参与植物体内物质运输的调控、植物生长发育的调控、植物营养代谢的调控、植物细胞周期的调控，并参与植物的光信号途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含有烟草14-3-3c基因的植物表达载体pk2-35S-14-3-3c，同时提供该载体的构建方法，以及利用该载体制备快速吸收和耐受甲醛的转基因植物。本专利技术所提供的载体含有烟草14-3-3c基因、CaMV35S强启动子，所述的14-3-3c基因的cDNA来源于烟草（Nicotianatabacum），GenBank登录号为U91724.1。上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pMD18-T(购于大连TaKaRa生物公司)，用于构建所属植物表达载体的最终载体为pK2GW7（购自FlandersInteruniversityInstituteforBiotechnology，VIB）。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术的技术方案如下：1、植物表达载体的构建（1）从GenBank中查找烟草14-3-3c基因的cDNA序列，并设计一对序列如下的引物；上游引物5'GTCGACTCTAAACATGGCGGTGGC3'（含有SalI位点）；下游引物5'GATATCTCAATTTTTGGCTTCATCAGG3'（含有EcoRV位点）；上游引物5’端添加SalI（GTCGAC）酶切位点；下游引物5’端添加EcoRV（GATATC）酶切位点，以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到14-3-3c基因的全长cDNA；（2）回收并纯化14-3-3c全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD18-T载体上，提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-T-14-3-3c；（3）构建入门克隆载体pENTR-2B-14-3-3c，用EcoRV和SalI酶切pMD18-T-14-3-3c和pENTR-2B，回收14-3-3c的cDNA片段，通过连接酶亚克隆到pENTR-2B，得到入门克隆载体pENTR-2B-14-3-3c；（4）构建植物过表达载体pK2-35S-14-3-3c，通过Gateway技术的LR反应把14-3-3c亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得14-3-3c基因的植物表达载体pK2-35S-14-3-3c。本专利技术的植物表达载体对能实施转基因操作的植物都适用，如烟草、拟南芥、矮牵牛、非洲菊等，在本专利技术的实施中以烟草为例说明该表达载体的应用过程。2、烟草的转化采用电击转化法转化质粒pK2-35S-14-3-3c进入农杆菌C58C1（pMP90）感受态细胞，涂布在Spe平板上生长两天后，用菌落PCR检测质粒是否转化到农杆菌中。通过农杆菌介导的叶盘转化法制备烟草(Nicotianatabacumcv.Xanthi)的无菌苗，然后通过组织培养获得小苗，筛选具有卡那霉素（Kan）抗性植株，将其转移到MS培养基（含有3%蔗糖）上继续培养，从而获得无菌的转基因烟草植株。3、14-3-3c基因转录水平的检测为了检测目的基因14-3-3c基因在转基因烟草中的表达量，提取抗性苗RNA，利用14-3-3c基因上下游引物进行RT-PCR检测，筛选出14-3-3c基因表达量显著上调的烟草植株。4、过量表达14-3-3c转基因烟草叶片对液体甲醛的吸收能力检测使用4mmol·L-1的甲醛溶液(含5mmol·L-1KHCO3、1%MES)，每个处理液加入2g新鲜的烟草叶片，置于25℃/24h(100μmol·m-2·s-1)光照，摇床转速100rpm进行HCHO胁迫处理,在6、12、24、48和72h时分别测定处理液中剩余HCHO的含量，处理完毕后分别从各实验组中取烟草叶片0.2g，用液氮速冻后置于-80℃保存备用。5、过量表达14-3-3c转基因烟草对液体甲醛的抗性检测（1）叶绿素含量的测定：取上述实验中处理72h后的烟草叶片，以预冷的无菌ddH2O冲洗叶片3~4次，纸巾吸干叶片表面残留的ddH2O，95%乙醇提取叶绿素，并以紫外分光光度法测定665和649nm处的吸光度A649和A665，根据以下公式计算叶绿素a和b的含量。叶绿素a含量(mg·g-1)=13.95×A665–6.88×A649；叶绿素b含量(mg·g-1)=24.96×A649–7.32×A665；（2）丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）含量的测定：取4mmol·L-1的液体甲醛胁迫处理48h的烟草叶片用于丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）含量的测定，其中MDA含量测定采用TBA方法，H2O2含量采用二甲酚橙法测定。本专利技术优点：本专利技术的重组载体pK2-35S-14-3-3c在转基因植株中的应用可提高植物对甲醛的吸收速率和抗性；实验结果表明在烟草中过量表达14-3-3c基因，使烟草在4mmol·L-1液体甲醛胁迫下的叶绿素降解放缓，丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)积累也减缓，因此增强了烟草叶片对于甲醛的抗性的同时促进本文档来自技高网...

【技术保护点】
烟草

【技术特征摘要】
1.烟草14-3-3c基因的植物表达载体pK2-35S-14-3-3c，其特征在于：所述烟草14-3-3c基因的GenBank登录号为U917...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽梅，冯永，司志浩，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53