一种提高埃博霉素A产量的发酵工艺方法技术

本发明专利技术公开了一种提高粘细菌次级代谢产物产量的方法，即提高粘细菌中埃博霉素（Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）产生菌纤维堆囊菌（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）的代谢产物埃博霉素Ａ产量的方法。该方法包括１）对成团生长的粘细菌液体均匀生长的驯化方法，２）适合埃博霉素Ａ产生的地瓜淀粉、水解乳蛋白等的选定以及３）综合地消除产物代谢积累的混合树脂添加方法等步骤，从而使得埃博霉素Ａ产物的产量达到６２．７ｍｇ／Ｌ的水平。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及提高粘细菌代谢产物产量的方法，具体地说涉及一种提高粘细菌中纤维堆囊菌的埃博霉素A产量的方法。埃博霉素较紫杉醇简单的结构、良好的水溶性和极大的药用潜力，使得人们投入了巨大的热情进行研究，以期更快的将其开发成为抗肿瘤药物。化学家们把很多的精力投入到埃博霉素及其类似物的合成和分离上，但是，对于生物法发酵制备埃博霉素，仅见哥特等人的方法(抗生素杂志，1996，49560-563)。该方法包括能够产生埃博霉素的纤维堆囊菌So ce90菌株，发酵容器为300ml三角瓶，发酵条件为马铃薯淀粉8g/L，葡萄糖2g/L，脱脂大豆蛋白2g/L，酵母浸汁2g/L，FeNaEDTA 8mg/L，CaCl2.2H2O1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，HEPES 11.5g/L，加入20ml/L的树脂XAD-16。接种后在30℃培养5天。埃博霉素A的产量约为23mg/L。上述发酵技术方法的不足在于1)由于粘细菌在液体中生长时的聚团性质，影响了菌体细胞数量的提高，从而限制了粘细菌代谢产物埃博霉素的产生；2)产生埃博霉素的发酵条件过于复杂，成本较高，并且马铃薯淀粉、葡萄糖、脱脂大豆蛋白和酵母浸汁不是埃博霉素产生的最适碳源和氮源；3)为减少粘细菌代谢产生的埃博霉素对产物的反馈抑制，在发酵过程中添加的XAD-16树脂价格昂贵，并且该种树脂仅能对低极性的代谢产物吸附，对于其他中等极性或高极性的代谢产物的反馈抑制没有作用等。针对上述不足，对相关技术和方法进行改进的文献或专利至今未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述粘细菌发酵产生埃博霉素技术和方法上的不足，提供一种提高埃博霉素A产量的方法，它可以有效地克服现有生产工艺的缺陷，具有产生菌的生长量大，培养条件简单和价格低廉等特点，为在工业生产中应用提供了基础。本专利技术的目的是通过如下的技术方案实现的，具体步骤顺序如下(1)发酵菌株的选择粘细菌菌株中纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384，ATCC25531和ATCC25569菌株之一；(2)粘细菌菌株在保持代谢产物合成能力前提下，液体培养均匀生长的驯化将上述菌株接种在固体斜面培养基上，固体培养基成分为大豆蛋白胨5～15g/L，马铃薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，琼脂粉15g/L；30℃，培养5天后，接种至液体发酵培养基，液体发酵培养基成分为大豆蛋白胨5～15g/L，马铃薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA8mg/L；30℃，120转/分摇床培养5~7天，将上述培养菌重新接回至固体培养基培养，依原条件培养后再接种至液体发酵培养基，如此重复传代驯化，在95～100代时，培养的菌株在液体发酵培养基中的生长呈现适应性的均匀化生长，表现为菌体细胞在液体中由原来的聚团状态变成了均匀生长状态，同时细胞生长的代时缩短，生长量提高，达到最大细胞量的时间由原来的10～12天，缩短至5～7天，获得的最大细胞量由原来的1～4×108细胞/ml，增加到5～10×109细胞/ml；(3)发酵培养条件的优化将步骤(2)均匀化生长的菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为碳源是地瓜淀粉、马铃薯淀粉、葡聚寡糖、木聚糖之一，浓度均为20g/L，氮源是水解乳蛋白、大豆蛋白胨、酒石酸铵、柠檬酸铵之一，浓度均为10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂选择XAD-16，添加量为20ml/L；发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养5～7天；(4)综合消除代谢产物对菌株产生埃博霉素的影响将上述菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为地瓜淀粉20g/L，水解乳蛋白10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂选择XDA，AB-8或混合树脂之一，添加量为10～40ml/L；发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养6～7天；(5)埃博霉素A的分离提取纯化发酵结束后，将液体发酵培养基中添加的树脂取出，经甲醇浸提，浸提物再经过离子交换，分子筛和高效液相提取纯化，即得到埃博霉素A。其中步骤(1)所述的发酵菌株选择纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384。其中步骤(2)所述的固体培养基成分为大豆蛋白胨8g/L，马铃薯淀粉20g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，琼脂粉15g/L。其中步骤(2)所述的液体发酵培养基成分为大豆蛋白胨10g/L，马铃薯淀粉21g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L。其中步骤(3)所述的液体发酵培养基的成分中碳源是地瓜淀粉。其中步骤(3)所述的液体发酵培养基的成分中氮源是水解乳蛋白。其中步骤(4)所述混合树脂的添加量为20ml/L。其中步骤(4)所述混合树脂是指CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比0.8～1.2∶0.8～1.2∶1.8～2.2∶0.8～1.2∶2.8～3.2∶1.8～2.2混合。其中步骤(4)所述混合树脂是指CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比1∶1∶2∶1∶3∶2混合。将上述发酵液中添加的混合树脂取出，加10倍体积甲醇浸提，浸提物经过离子交换，分子筛和高效液相纯化。纯化得到的化合物，分别测定了质谱(见附附图说明图1)，紫外谱图(见附图2)和核磁共振谱图(见附图3和4)，确认了埃博霉素(Epothilone)A结构(附图5)。表1的结果显示了菌株液体均匀生长驯化后的埃博霉素A产量。本项技术的创造性在于1)通过液体均匀生长驯化方法，改变粘细菌生长的成团性质，从而提高菌体的生长细胞密度，并且菌体细胞的生长代时缩短，缩短了发酵周期；2)该方法是以发酵培养基为驯化生长培养基，从而使得液体均匀生长的菌株对发酵培养基有更好的适应性，避免了驯化菌株丢失埃博霉素产生能力的情况。本项技术获得的结果是均匀生长的菌株产生埃博霉素A的产量是成团生长的野生菌株的三倍。表1菌株 原始菌株 液体均匀生长驯化菌株埃博霉素A(mg/L)12.3 33.7表2是不同碳源对液体均匀生长驯化菌株的埃博霉素A合成的影响。其中地瓜淀粉、马铃薯淀粉、葡聚寡糖、木聚糖、葡萄糖等对埃博霉素A的产生具有明显的促进作用。表2浓度 埃博霉素A 浓度 埃博霉素A碳源 碳源(g/L) (mg/L) (g/L) (mg/L)地瓜淀粉 20 49.5 葡萄糖 8 33.6 表3是不同氮源对液体均匀生长驯化菌株的埃博霉素A合成的影响。其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高埃博霉素Ａ产量的发酵工艺方法，该方法具体步骤顺序如下：（１）发酵菌株的选择：粘细菌菌株中纤维堆囊菌（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）ＡＴＣＣ１５３８４，ＡＴＣＣ２５５３１和ＡＴＣＣ２５５６９菌株之一；（２）粘细菌菌 株在保持代谢产物合成能力前提下，液体培养均匀生长的驯化：将上述菌株接种在固体斜面培养基上，固体培养基成分为：大豆蛋白胨５～１５ｇ／Ｌ，马铃薯淀粉１５～２５ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ↓［２］．２Ｈ↓［２］Ｏ １ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ↓［４］．７Ｈ↓［２］Ｏ １ｇ／Ｌ，Ｆｅ－ＥＤＴＡ ８ｍｇ／Ｌ，琼脂粉１５ｇ／Ｌ；３０℃，培养５天后，接种至液体发酵培养基，液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨５～１５ｇ／Ｌ，马铃薯淀粉１５～２５ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ↓［２］．２Ｈ↓［２］Ｏ １ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ↓［４］．７Ｈ↓［２］Ｏ １ｇ／Ｌ，Ｆｅ－ＥＤＴＡ ８ｍｇ／Ｌ；３０℃，１２０转／分摇床培养５～７天，将上述培养菌重新接回至固体培养基培养，依原条件培养后再接种至液体发酵培养基，如此重复传代驯化，在９５～１００代时，培养的菌株在液体发酵培养基中的生长呈现适应性的均匀化生长，表现为菌体细胞在液体中由原来的聚团状态变成了均匀生长状态，同时细胞生长的代时缩短，生长量提高，达到最大细胞量的时间由原来的１０～１２天，缩短至５～７天，获得的最大细胞量由原来的１～４×１０↑［８］细胞／ｍｌ，增加到５～１０×１０↑［９］细胞／ｍｌ；（３）发酵培养条件的优化：将步骤（２）均匀化生长的菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，３０℃，培养５天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为：碳源是地瓜淀粉、马铃薯淀粉、葡聚寡糖、木 聚糖之一，浓度均为２０ｇ／Ｌ，氮源是水解乳蛋白、大豆蛋白胨、酒石酸铵、柠檬酸铵之一，浓度均为１０ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ↓［２］．２Ｈ↓［２］Ｏ １ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ↓［４］．７Ｈ↓［２］Ｏ １ｇ／Ｌ，Ｆｅ－ＥＤＴＡ ８ｍｇ／Ｌ，树脂选择ＸＡＤ－１６，添加量为２０ｍｌ／Ｌ；发酵容器为５００ｍｌ三角瓶，内含２００ｍｌ液体发酵培养基，培养温度为３０℃，摇床转速为１２０转／分，培养５～７天；（４）综合消除代谢产物对菌株产生埃博霉素的影响：将上述菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，３ ０℃，培养５天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为地瓜淀粉２０ｇ／Ｌ，水解乳蛋白１０ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ↓［...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李越中，胡玮，刘新利，韩冠君，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]