真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及其制备方法技术

一种真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及其制备方法，通过文库筛选和ＥＳＴ序列分析，克隆出真鲷抗菌肽（ｈｅｐｃｉｄｉｎ）基因，将该基因重组到酵母表达载体ｐＰＩＣＺα　　Ａ，构建成抗菌肽基因表达质粒ｐＰＩＣＺ－ｒｓｂＨＥＰＣ１，转化毕赤酵母后，获得了稳定表达真鲷抗菌肽的酵母菌株。细菌生长抑制实验表明重组抗菌肽对大肠杆菌，绿脓杆菌和嗜水气单胞菌等４种细菌均具有剂量依存的抑制活性。本发明专利技术首次构建了鱼类抗菌肽（ｈｅｐｃｉｄｉｎ）基因酵母表达质粒并研制了重组抗菌肽表达产物，该表达质粒在酵母体内表达稳定，重组抗菌肽分子量小，抑菌活性明显，适宜用作鱼类等水产动物的饲料添加剂。本发明专利技术适用于各种鱼类抗菌肽基因克隆和表达载体的构建，生产的基因工程鱼类抗菌肽可作为饲料添加剂，用于鱼类等水产动物的疾病防治。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
中的鱼类基因工程范畴，是一种能在鱼类病害防治中应用的鱼类抗菌肽基因与酵母重组表达载体及其制备方法。
技术介绍
鱼类是特异性免疫和非特异性免疫并存的脊椎动物。但与哺乳类相比，鱼类的特异免疫系统尚不够发达，特异性免疫机制还不完善。因此，在鱼类对外界刺激及病原生物侵袭的防御反应中，非特异性免疫起着重要作用。现已知参与鱼类非特异性免疫反应的因子主要包括巨噬细胞、粒细胞和细胞毒性细胞等一些具有吞噬作用的细胞，以及介导一系列免疫或应激反应的蛋白分子，如补体、细胞因子、趋化因子及溶菌酶和抗菌肽等。抗菌肽是一类可以抵抗多种病原菌感染的非特异性免疫因子。过去几年，抗菌肽在植物和小鼠上研究较多，并得到成功应用。研究表明，抗菌肽基因转移明显提高了植物(Liu et al.，1994)和小鼠的抗病能力(Reedet al.，1997)；相类似，抗菌肽在鱼、虾抵抗病原感染过程中也起着重要作用。美国和法国科学家在虹鳟、泥鳅和对虾抗菌肽分离纯化上做了一些工作(Park et al.，1997；Destoumieux et al.，1997)。鱼类的肝脏、皮肤、腮、头肾、肠和皮肤分泌物里本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及制备方法，其特征在于它的真鲷抗菌肽基因的克隆主要包括ｃＤＮＡ文库构建、ＥＳＴ序列测定和ＤＮＡ序列分析与比对：ｃＤＮＡ文库构建：用ＴＲＩｚｏｌ试剂盒从真鲷脾脏中提取总ＲＮＡ，用０１ｉｇｏｔｅｘ↑［ ＴＭ］离心柱试剂盒分离Ｐｏｌｙ－（Ａ）ＲＮＡ，用ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＸＲｃＤＮＡ文库试剂盒构建ｃＤＮＡ文库；ＥＳＴ序列测定：用快速微量制备方法制备质粒ＤＮＡ，质粒制备在９６孔板上完成；用Ｔ３定序试剂盒测定ｃＤＮＡ片段 的序列，用Ｔ３和Ｔ７引物从ｃＤＮＡ片段的两端分别进行测序，从而获得全长序列；ＤＮＡ序列分析与...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈松林，徐美瑜，隋少飞，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]