一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，所述谷氨酰胺转胺酶由序列表ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ１所示的核苷酸序列所编码的序列表ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ２所示的氨基酸序列，一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，包括如下步骤：（１）根据茂原链轮丝菌微生物谷氨酰胺转胺酶的核苷酸序列，设计ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增，获得表达谷氨酰胺转胺酶的基因片段，通过ＮｄｅＩ和ＸｈｏＩ双酶切，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中，构建表达载体ｐＥＴ－ＭＴＧ，并转化大肠杆菌成为工程菌；（２）重组ＭＴＧ包涵体的纯化和复性，即得到一种由序列表ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ２所示的氨基酸序列的谷氨酰胺转胺酶。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，其特征是包括如下步骤：（１）根据茂原链轮丝菌微生物谷氨酰胺转胺酶的核苷酸序列，设计ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增，所述ＰＣＲ引物的正向引物为ＳＥＱＩＤＮｏ３所示，所述ＰＣＲ引物的反向引物为ＳＥＱＩ ＤＮｏ４所示，获得表达谷氨酰胺转胺酶的基因片段，所述谷氨酰胺转胺酶的基因片段由序列表ＳＥＱＩＤＮｏ１所示，通过ＮｄｅＩ和ＸｈｏＩ双酶切，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中，构建表达载体ｐＥＴ－ＭＴＧ，并转化大肠杆菌成为工程 菌；（２）重组ＭＴＧ包涵体的纯化和复性：诱导后的工程菌，经超声破菌后离心取沉淀，再经过洗涤获得ＭＴＧ包涵体；将纯化的包涵体溶于２０ｍｏｌ、ｐＨ＝８．０Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中，使包涵体蛋白浓度为１８～２２ｍｇ／ｍｌ，所述Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中 含８ｍｏｌ／Ｌ尿素，２０ｍｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇和１ｍｍｏｌ／Ｌ乙二铵四乙酸二钠，室温搅拌１～３小时，离心去除沉淀后，用ＨＣｌ调ｐＨ至３～５，再次离心去除沉淀，用２０ｍｍｏｌ、ｐＨ４．０的乙酸缓冲液稀释５０倍，４℃搅拌放置５～１５ｈ，用ＮａＯＨ水溶液调ｐＨ至６．０～７．０，离心去除沉淀后，用１０倍体积的２０ｍｍｏｌ、ｐＨ＝６．０磷酸缓冲液，透析二次，复性产物，上ＳＰ－琼脂糖凝胶柱，用ｐＨ＝６．０磷酸缓冲液洗去未结合的成分，再用０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ水溶液洗脱，洗脱液透析后 进行超滤浓缩，冻干，即得到一种由序列表ＳＥＱＩＤＮｏ２所示的氨基酸序列的谷氨酰胺转胺酶。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩忠朝，徐斌，杨萍，孟磊，
申请(专利权)人：天津昂赛细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]