本发明专利技术提供一种新的微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示，其中，第10位上的氨基酸为丝氨酸、组氨酸或苏氨酸；第241位上的氨基酸为甘氨酸、苏氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸为缬氨酸、酪氨酸或丙氨酸。所述微生物谷氨酰胺转胺酶在常温下具有强比活力，用于交联明胶，可用作止血材料。
Microbial transglutaminase and its application
The present invention provides a new microbial transglutaminase transglutaminase (MTG), the sequence of amino acids such as SEQ? ID? No.3 shows, among them, tenth amino acid position for serine or threonine, histidine; 241st amino acid of glycine, alanine or threonine; 284th amino acid of valine, tyrosine or alanine. The microbial transglutaminase activity is stronger than under normal temperature for crosslinked gelatin can be used as a hemostatic material.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶工程领域，具体涉及一种微生物谷氨酰胺转胺酶(MicrobialTransglutaminase,简称 MTG)及其应用。
技术介绍
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase, EC 2.3.2. 13,简称TG)可以催化酰基转移反应，催化蛋白内谷氨酰胺Y-甲酰基与赖氨酸的e-氨基交联。在原核生物和真核生物中均存在TG。而微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)由于其不依赖于钙的活性，自从被发现以后就被广泛应用于工业，在食品、化工、医药等行业均有广泛使用。 微生物谷氨酰胺转胺酶(microbial transglutaminase缩写MTG)与凝血因子FACTOR XIII同属于一个家族的酶，具有与其类似的作用效果，很多研究表明了其在凝血反应中的作用。利用MTG可以交联明胶，形成良好的多空物或者网状物，可以在多方面应用，例如交联I型胶原蛋白，形成抗高温的胶(Nomura Y, Toki S，Ishii Y, ShiraiK. Biosci Biotechnol Biochem. 2001Apr; 65 (4) :982-5), MTG 与明胶作用形成的胶不会受热溶解(Chen T, Embree HD, Brown EM, Taylor MM, Payne GF. , Biomaterials. 2003Aug;24(17) :2831-41，美国专利5，834，232)并可用于细胞固定(Chen T, Small DA, McDermottMK, Bentley WE, Payne GF.，Biomacromolecules. 2003Nov_Dec; 4 (6) : 1558-63)，生物支架(Broderick EP,0’Halloran DM, Rochev YA, Griffin M, Collighan RJ, Pandit AS. J BiomedMater Res B Appl Biomater. 2005Jan 15;72(I):37-42. ；Chen RN, Ho HO, Sheu MT. Biomaterials. 2005Jul; 26 (20) :4229-35)。可以用MTG增加明胶的交联，以提高其强度和黏性，从而用于制作止血材料、止血敷料或止血用密封材料(McDermott MK, Chen T, WilliamsCM, Markley KM, Payne GF. Biomacromolecules. 2004 Jul-Aug; 5 (4) : 1270-9 ;中国专利200980131973. 6 和 200780051215. 4 ;美国专利8, 133，484 ；欧洲专利TO2012017415、W02011132153、BRPI0718328、ZA200904470、EP2303344、EP2303341 及 CN102124058)。对于医疗产品来说，酶的稳定性十分重要，特别是对于常温保存的产品来说更是如此。但是MTG的最佳反应温度一般在50°C _55°C左右，在常温(25°C )时酶活只有最佳反应温度的20%左右，即使是在体温(37°C )左右，酶活也只有最佳酶活的一半左右(BuettnerK, Hertel TC, Pietzsch M, Amino Acids. 2012,42(2-3):987-96. ；Marx CK,HertelTC, Pietzsch M, J Biotechnol. 2008 Sep 10; 136 (3-4) : 156-62.) 此外，MTG 酶的热稳定性比较差，60°C 10分钟可以导致MTG酶活损失80%左右(Marx CK, Hertel TC, Pietzsch M,J Biotechnol. 2008 SeplO;136 (3-4):156-62.) 有文献报道具有热稳定性MTG的突变位点包括2位的丝氨酸突变为酪氨酸，23位的丝氨酸突变为缬氨酸或酪氨酸，24位的酪氨酸突变为天冬酰胺，294位的赖氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸；101位的丝氨酸突变为脯氨酸，250位的甘氨酸突变位有氨酸，157位的甘氨酸突变为丝氨酸。本专利技术提出一种新的微生物谷氨酰胺转胺酶，其氨基酸序列结构不同于已经文献报道，突变位点具有特定的组合，且最佳活性温度向较低温度偏离，还具有较好热稳定性。
技术实现思路
本专利技术克服现有技术以上缺陷，提出了一种新的微生物酰胺转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，其中，第10位上的氨基酸为丝氨酸、组氨酸或苏氨酸；第241位上的氨基酸为甘氨酸、苏氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸为缬氨酸、酪氨酸或丙氨酸。进一步地，所述第10位上的氨基酸为丝氨酸或者苏氨酸；所述第241位上的氨基酸为丙氨酸或者甘氨酸；所述第284位上的氨基酸缬氨酸或者酪氨酸。进一步地，本专利技术的第10位氨基酸还可以是谷氨酰胺、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、组氨酸或者苏氨酸；第241位氨基酸还可以是谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸或者丙氨酸；第284位氨基 酸还可以是谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或者丙氨酸。本专利技术中，所述微生物酰胺转氨酶活性的反应温度在25-75摄氏度之间。优选地，其酶活性的反应温度在25-45摄氏度之间。更优选地，其酶活性为在25摄氏度时所述酶活性仍然不低于35U。本专利技术微生物酰胺转氨酶的制备方法，包括以下步骤合成如SEQ ID NO. 8所示序列，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a并将其转化到大肠杆菌BL21中，得到基因工程菌。将该基因工程菌发酵表达，并破碎菌体，用亲和层析含有突变的MTG的融合蛋白。向融合蛋白溶液中按照融合蛋白的质量加入1/10质量的分散酶，37摄氏度作用30分钟，用DEAE离子交换法纯化。最终可以获得突变MTG蛋白。本专利技术还提供了一种微生物酰胺转氨酶的应用，是将如权利要求I所述的微生物酰胺转氨酶在10-75摄氏度下交联明胶。优选地，在25-45摄氏度下交联明胶。更优选地，在室温(25摄氏度)下将微生物酰胺转氨酶与明胶组合应用。本专利技术微生物酰胺转氨酶在室温下催化明胶交联的效率远远高于野生型的微生物酰胺转氨酶。所述微生物酰胺转氨酶用于催化明胶交联，还可用于制备止血剂。本专利技术微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)，可通过紫外诱变筛选得到，在70°C高温条件处理后该MTG仍然体现了很高的残余酶活。研究表明，本专利技术微生物谷氨酰胺转胺酶的最佳活性温度为40°C -50°C，优选为40°C，而野生型MTG的最佳活性温度为55°C，可见，本专利技术微生物谷氨酰胺转胺酶的最佳活性温度明显较低，且在常温及室温如25V _37°C时其比酶活显著高于野生型MTG。通过DNA测序结果显示，与野生型MTG相比，本专利技术微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)发生了突变，例如，突变为第10位的丙氨酸或丝氨酸、第241位的脯氨酸或丙氨酸、第284位的丝氨酸或缬氨酸。发生了突变变异的本专利技术MTG在常温下交联蛋白的能力大大提高，从而可以在常温高效粘合蛋白，可有效用于明胶制品的交联。本专利技术微生物谷氨酰胺转胺酶(MT本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种微生物酰胺转氨酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，其中，第10位上的氨基酸为丝氨酸、组氨酸或苏氨酸；第241位上的氨基酸为甘氨酸、苏氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸为缬氨酸、酪氨酸或丙氨酸。2.如权利要求I所述的微生物酰胺转氨酶，其特征在于，所述第10位上的氨基酸为丝氨酸或苏氨酸；所述第241位上的氨基酸为丙氨酸或甘氨酸；所述第284位上的氨基酸为缬氨酸或酪氨酸。3.如权利要求I所述的微生物酰胺转氨酶，其特征在于，其酶活性的反应温度在25-75摄氏度之间。...
【专利技术属性】
技术研发人员：金明飞，刘明耀，高红亮，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：
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