一种生产糖蛋白疫苗的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产糖蛋白疫苗的方法。本发明专利技术生产糖蛋白疫苗的方法是将糖蛋白基因导入α－１，６－甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母中生产糖蛋白，以所述糖蛋白作为疫苗的活性成分。本发明专利技术生产的糖蛋白疫苗中的活性成分是低糖基化的糖蛋白，其免疫诱导产生抗体的能力明显优于普通酵母生产的过度糖基化糖蛋白和大肠杆菌生产的非糖蛋白，本发明专利技术生产糖蛋白疫苗的方法生产的疫苗可以提高抗体滴度、降低抗原用量和减少免疫次数。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。技术背景毕赤酵母已成为近年来发展最快的酵母表达系统，广泛用于各种重组蛋白表达， 尤其在疫苗生产中具有明显优势。毕赤酵母与大肠杆菌相比，它可用于复杂蛋白表达，且表达蛋白具有天然生物活性或构型。与其它酵母相比，它还具有外源蛋白分泌能力强、蛋白表达水平高和适合 于高密度培养等优点。与哺乳动物细胞表达系统相比，它又具有生长快、便于基因操 作、大规模培养和培养成本低廉等优势。毕赤酵母可以对其表达的蛋白进行N-糖基化修饰，糖基化修饰对蛋白质的正确折 叠、稳定性和生物活性至关重要。但毕赤酵母的N-糖基化修饰与哺乳动物细胞有明显 区别，哺乳动物细胞的N-糖基修饰， 一般每个糖基含10-20个单糖，分子量为1500-3000。 而毕赤酵母的N-糖基化修饰常常为过度糖基化修饰，每个糖基可以含三十至上百个甘 露糖，分子量为四千至数万，糖蛋白分子量明显增大，而且由于过度糖基化修饰往往 不均一，因而糖蛋白分子量也不均一，SDS-PAGE分析时出现明显"拖尾"。毕赤酵母用于糖蛋白疫苗生产时，这种过度糖基化修饰可遮蔽抗原表位，降低抗 原的免疫原性。在酵母表达系统中，简单地通过将蛋白上的糖基化位点突变来去除蛋 白过度糖基化修饰对抗原的遮蔽又可能会带来新的问题如酵母表达的HBV的pre-Sl 和pre-S2都会被过度糖基化修饰，形成含有30多个甘露糖残基的糖链，将pre-Sl和 pre-S2的糖基化位点都突变后，免疫原性虽然比过度糖基化修饰的要强，但却出现了 合成困难，易被蛋白酶降解的问题，难以用于产业化生产(JeewonLee， Jin-Seung Park, Je-Young Moon， et s7. The influence of glycosylation on secretion, stability, and immunogenicity of recombinant HBV pre-S antigen synthesized in Saccharomyces cerevisiae. Biochem Biophy Res Commun，2003,303 (2): 427-432.)。ot-l， 6-甘露糖基转移酶是酵母在高尔基体中向来自内质网的蛋白N-糖基 (N-GluNac2Man8)上加上第一个a-1， 6-甘露苷的糖基转移酶，其产物N-GluNac2Mang是 后续甘露糖基转移酶的底物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术所提供的生产糖蛋白疫苗的方法，是将糖蛋白基因导入a-1,6-甘露糖转 移酶基因灭活的毕赤酵母中构建重组菌，用所述重组菌生产糖蛋白，以所述糖蛋白作 为疫苗的活性成分。其中，本专利技术所述的糖蛋白可以是各种可作为疫苗的糖蛋白及其变异体，如流感 神经氨酸酶、流感血凝素、含preS的乙肝病毒表面大抗原、HIV病毒的GP120蛋白、 丙肝的E1抗原、丙肝的E2抗原、SARS的刺突蛋白、单纯疱疹病毒糖蛋白、狂犬病毒 糖蛋白、嗜B细胞病毒gP340蛋白、日本脑炎病毒糖蛋白或典型猪瘟病毒糖蛋白E2等。 优选的糖蛋白为流感神经氨酸酶或含preS的乙肝病毒表面大抗原。所述生产糖蛋白疫苗的方法中，还可包括将所述糖蛋白与佐剂混合。佐剂和糖蛋 白混合使用，不但有助于注射物质的沉积或汇集，而且能增强抗体反应，所述佐剂可 为现有的多种佐剂，如氢氧化铝或MF59等。a -l, 6-甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母可以是通过敲除部分或全部的 a-l，6-甘露糖转移酶基因(序列表中序列3)序列，也可以通过诱变或筛选自发突变 株获得，其中较优的是敲除部分或全部的基因序列，所述敲除部分的基因序列较优的 是指敲除至少10%的a -1， 6-甘露糖转移酶基因序列，更好的是敲除其启动子序列或编 码序列。一种优选的a-l，6-甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母是敲除了 a-1,6-甘 露糖转移酶基因约1000bp编码序列的毕赤酵母GJK0601 CGMCCNo. 1853(简称为GJK)， 其详细构建方法见实施例1。与诱变或自发突变株产生的点突变中的单个碱基的变化 不同，这种a-l，6-甘露糖转移酶部分或全部基因序列的敲除，具有不易产生回复突 变的优势，这在疫苗大规模生产中具有重要的意义。因为在疫苗规模生产时，如果出 现少量菌株的回复突变，由于回复突变后的菌株生长速度比cx-l， 6-甘露糖转移酶缺陷 株快，因此随着生长时间的延长，回复突变的野生表型菌株就会讯速增加，从而导致 表达的糖蛋白上糖基结构的改变。这样就会导致生产过程的不稳定和难以控制。所述通过敲除部分或全部的a -1， 6-甘露糖转移酶基因序列灭活的重组毕赤酵母 具体可用如下方法获得1)在载体的多克隆位点插入a -1， 6-甘露糖转移酶基因的上游同源区和下游同源 区构建a-1,6-甘露糖转移酶基因灭活载体；所述a-1，6-甘露糖转移酶基因的上游同 源区为如下A)或B)的DNA片段，所述a-l，6-甘露糖转移酶基因的下游同源区为如A) 大小为至少200bp的DNA片段，该片段选自序列表中序列3;B) 在严格条件下与A)限定的DNA片段杂交的片段；C) 大小为至少200bp的DNA片段，该片段选自序列表中序列3，且该片段位于所 述片段A)的下游，与所述片段A)相距至少10。/。a-l，6-甘露糖转移酶基因序列；D) 在严格条件下与C)限定的DNA片段杂交的片段；2)将所述a -1， 6-甘露糖转移酶基因灭活载体导入毕赤酵母中获得重组毕赤酵母。 上述严格条件可为在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC) ， 0. 1% SDS的溶液中，在65°C下 杂交并洗膜。为了便于筛选，在上游同源区和下游同源区中间可以带有作为筛选标记的基因， 如抗生素抗性基因(如Zeo、 Kan等)、营养缺陷补偿基因(如His4、 Arg、 ADE、 URA3 等)。这种用于重组的核酸片段可以通过PCR的方法获得或着用人工合成的方法获得。 相应的序列可以从公开的数据库获得，如毕赤酵母的a-l， 6-甘露糖转移酶基因序列， 在美国国立医学图书馆的GenBanK中已经公开(收录号E12456)。毕赤酵母可以从商业 化的或各菌种保藏中心获得，如毕赤酵母GS115可以从美国invitrogen公司购买。将重组灭活载体或片段导入酵母中可以用电转化、PEG转化法(如J.萨姆布鲁克 等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002)，将转化后的菌体涂布在与质 粒中选择性标记相对应的筛选培养基上，筛选阳性克隆。可以通过PCR、 Southern杂交 等方法确证敲除是否正确。本专利技术实施例l提供了一种敲除部分a -1， 6-甘露糖转移酶基因序列灭活该酶的重 组毕赤酵母构建的详细方法。所述将糖蛋白基因导入a-l,6-甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母中生产糖 蛋白的方法，可以用各种酵母表达载体，具体可为pPIC9、 pPICZ、 pHIL-D2或pHIL-Sl。 这些基因在毕赤酵母中的表达可以用与该酵母相适应的各种启动子控制，优选的是醇 氧化酶启动子A0X1。这些糖蛋白的氨基酸序列及编码这些氨基酸序列的核酸序列可以从各种公开的文 献、书籍和公共数据库中获得，如从美国国立医学图书馆的GenBank获得，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产糖蛋白疫苗的方法，是将糖蛋白基因导入α－１，６－甘露糖转移酶基因灭活的毕赤酵母中构建重组菌，用所述重组菌生产糖蛋白，以所述糖蛋白作为疫苗的活性成分。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴军，刘波，唱韶红，巩新，马清钧，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]