农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法技术

本发明专利技术涉及农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，包括以下步骤：１）将含有目的基因的农杆菌用转化培养液悬浮；２）在大田条件下对活体进行花序浸泡法转化：在雌花花丝吐出５～１０ｃｍ，雄花序主花轴有少于３０％的小花开始散粉时，将待转化玉米植株的雌花序或雄花序浸泡于上述转化培养液中，或将上述转化培养液洒到待转化的玉米植株的雌花序或雄花序上，通过农杆菌介导，将目的基因整合到植株的目的基因组中。本发明专利技术利用这种转基因方法，解决了常规转基因方法转化率低的问题，具有较大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物转基因方法领域，涉及利用农杆菌介导的禾谷类作物基因 转化方法，特别是玉米遗传转化的方法。
技术介绍
玉米，学名玉蜀黍，属禾本科玉米属Uea /nays L.)，原产于美洲大陆的墨 西哥、秘鲁及智利。玉米属于C4高产粮食作物，是世界三大粮食作物之一，在 世界粮食生产中占有重要地位。20世纪80年代以前，玉米品种更新换代主要采用常规育种方法，即通过有 性杂交实现基因重组，依据表型进行人工选择，实现优良基因重组。这种方法 已有上百年历史，也育成了成千上万个优良作物品种，对农业生产做出了重大 贡献，但由于作物的表型性状易受外界环境条件干扰和季节的影响，育种周期 长(6 8年)、规模(如土地)大，但效率却很低，预见性也差；此外，有性杂 交受到种间隔离的限制，在一定程度上限制了可利用基因资源的范围。植物转 基因技术的迅猛发展，推动了作物转基因育种技术的迅猛发展，不仅使作物的 转基因工程技术育种成为可能，而且取得了传统常规育种技术难以达到的效果 和效益。作物转基因技术己成为农业生物技术的核心领域，它正在成为作物遗 传改良一种极为重要的辅助手段，世界各国纷纷将作物转基因工程育种技术作 为国家战略予以推动和发展，尤其是玉米转基因工程育种技术已成为各国玉米 生物技术育种的发展重点和优先领域。玉米的转基因方法主要有两大类农杆菌介导转化法和无需载体的DNA直接导入转化法。DNA直接导入转化法主要包括基因枪法、花粉管通道法、子房注射 法、PEG法、电击法、阳离子转化法等。无论何种外源基因转化方法，都需要依 靠转化细胞的脱分化和在分化这一组织培养植株的再生过程，实现外源基因的 转移，获得转基因植株。玉米组织培养效率受基因型限制较大，许多基因型材料都存在着愈伤组织诱 导频率低、愈伤组织质量差、转化再生植株难、畸形苗多等现象，这直接影响 了遗传转化技术的运用范围及遗传转化中转化体的筛选和植株再生。此外，试 管苗存活率较低是玉米组织培养技术尚需提高的一个环节，试管苗的成功移栽 是较困难的步骤，污染是组织培养过程中经常遇到的问题，褐化也是组织培养 过程中经常遇到的问题。它们均不同程度地制约了玉米组织培养的成效。花序浸蘸法(flroaldip)属于原位渗透法的一种。该方法避开了组织培养 阶段，排除了因组织培养中体细胞变异所产生的对目的基因的遗传学研究及正 确表达极为不利的遗传背景，同时为一些组织培养不易成苗的作物种类提供了 有效的基因转移新方法。该方法与其它转基因方法相比较，其优越性在于①不 受宿主植物基因型的影响，可以将外源基因导入难以建立再生系统的植物中； ②操作简单，无需经过烦琐的组织培养阶段，大大减少了产生体细胞无性系变 异的可能性；③对精密仪器和昂贵药品的依赖较小，所投入的人力、物力、财 力很少；④可以在短期内获得大量的转基因植株，创造大量的突变株，对功能 基因组的研究意义重大。功能基因研究是基因工程研究的核心，然而功能基因 组的研究要以获得大量突变体为基础，花序浸蘸法在短期内能获得大量转基因 植株。因此，花序浸蘸法对功能基因组研究和转基因育种均具有深远意义。
技术实现思路
5本专利技术以花序浸蘸法为基础，提供一种高效的 玉米遗传转化的方法。1. 将含有目的基因的农杆菌用转化培养液悬浮，所述转化培养液以改良的N6培养基为基本营养成分，附加物有表面活性剂CS040、 Triton X-100、乙酰 丁香酮(AS)、赤霉素(GA) 、 6-卞氨基腺嘌呤(6-BA)、生长素(IM)、水 解酪蛋白、L-脯氨酸和甘露醇。2. 对活体进行花序浸泡法转化在雌花花丝吐出5 10cm，雄花序主花轴有 少于30%的小花散粉时，将待转化玉米植株的雌花序或雄花序浸泡于上述转化培 养液中，或将上述转化培养液洒到待转化的玉米植株的雌花序或雄花序上，利 用农杆菌介导，将目的基因整合到植株的目的基因组中。花序浸蘸法转化常采用抽真空的方法提高转化效率，然而对株型较大的植物 显然不适宜，因此在大田条件下进行转化须对常规使用的共培养转化液进行改 良。除正确的植物发育状态外，含农杆菌的转化培养液中的蔗糖含量和表面剂 两种成分是成功转化所需的另两个关键因素。目前常用的添加剂是有机硅表面 活性剂Silwet L -77。本专利技术首次采用了德国Cognis公司生产的蓖麻油聚氧乙 烯醚表面活性剂CS040替换Silwet L-77。 CS040的作用主要为乳化和分散润湿， 可在液珠表面形成具有一定强度和稳定性的保护膜，田间操作可降低液珠蒸发， 增加农杆菌浸染花序的机会。Triton X-100 (曲拉通X-100)化学名称为聚乙 二醇辛基苯基醚，是一种优异的非离子表面活化剂，具有润湿及洗涤剂的作用， 同时还可用来做细胞破膜剂/细胞通透剂，即在细胞膜上打孔，这样有助于农杆 菌顺利进入细胞体内，增加转化几率。AS，即乙酰丁香酮，它是vir基因的天 然诱导剂，可用来激活vir基因，利于外源基因的转化。GA，即赤霉素，是一 类属于双萜类化合物的植物激素，能促进细胞的伸长和分裂，促进萌发、开花和坐果，还可以防止果皮腐烂。6-BA是细胞分裂素，与生长素IAA配合使用， 主要功能是促进细胞、分裂。植物激素的主要作用是修复农杆菌浸染造成的伤 口，以利于植物细胞成长。本专利技术中选用甘露醇用来代替蔗糖，起到调节细 胞渗透压的作用，用甘露醇而不用蔗糖的原因是玉米大田生产中使用糖分过 多的转化培养液太多会招来更多的玉米害虫。本专利技术中，转化培养液中的CS040的用量为30 300ul/L， TritonX-100的 用量为10 100lil/L， AS用量为10~30mg/L， GA用量为1~5 u g/L， 6-BA用量为 0.5~2ug/L， IM用量为0. 5 lmg/L，水解酪蛋白用量为10(T500mg/L， L-脯氨 酸用量为0. 5 2mg/L，甘露醇用量为1(T20mg/L。含有目的基因农杆菌的获得，是通过将目的基因插入到表达载体中后，再将 该载体转化导入农杆菌。常用载体包括、但不限于pCAMBIA系列载体(如 pCAMBIA1304等)；常用菌株包括、但不限于C58、 EHA105、 LBA4404等。本专利技术利用这种转基因方法，解决了常规转基因方法转化率低(不足1%) 的问题，具有较大的应用价值。本专利技术已经成功地获得了玉米转基因植株。下面结合附图，通过具体实施例对本专利技术作进一步说明。附图说明图1质粒pCAMBIA1302图谱图2质粒pCAMBIA1302酶切图谱图3当代玉米花丝GFP瞬时表达观察图4、图5当代玉米花粉粒GFP瞬时表达观察图6、图7玉米雌花转化后收获的TO代种子中GFP的荧光观察图8、图9、图10玉米雄花转化后收获的TO代种子中GFP的荧光观察图11、图12普通未转化玉米种子荧光观察 图13、阳性植株的PCR检测具体实施方法，具体如下-1、 实验材料1) 植物材料选用优良玉米自交系18599红(18R)、 18599白(18W)作为供试植物材料。 材料由四川农业大学玉米研究所保存。2) 菌株根癌农杆菌(爿grobacteri咖tu/nefacians ): C58 (月因月旨减型nopaline)， 购自中国农业菌种保藏中心。3) 质粒选用澳大利亚CA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，包括以下步骤：　１）将含有目的基因的农杆菌用转化培养液悬浮，所述转化培养液以改良的Ｎ６培养基为基本营养成分，附加物有表面活性剂ＣＳＯ４０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、乙酰丁香酮（ＡＳ）、赤霉素（Ｇ Ａ）、６－苄氨基腺嘌吟（６－ＢＡ）、生长素（ＩＡＡ）、水解酪蛋白、Ｌ－脯氨酸和甘露醇；　２）在对活体进行花序浸泡法转化：在雌花花丝吐出５～１０ｃｍ，雄花序主花轴有少于３０％的小花散粉时，将待转化玉米植株的雌花序或雄花序浸泡于上述转化培 养液中，或将上述转化培养液喷洒到待转化的玉米植株的雌花序或雄花序上，利用农杆菌介导，将目的基因整合到植株的目的基因组中。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘光堂，畅乃迪，张志明，马永毅，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]