本发明专利技术公开了一种用农杆菌转染棉花花粉的遗传转化和筛选方法，属于遗传转化方法技术领域。本发明专利技术通过配制特异的农杆菌感染的花粉萌发培养基；将带有双元载体质粒pCB4-bar的农杆菌通过真空渗透感染刚萌发的花粉，再将感染后的花粉授粉于柱头，通过花粉管途径将遗传物质传递给子代，获得转基因植株。本实验以抗除草剂基因bar作为目的基因，通过农杆菌转染花粉法转化棉花，同时优化部分影响转化的因素，筛选出适合转化的最适条件，优化后的农杆菌感染花粉的转化率可达1.3％，获得的转化后代植株Basta抗性分离符合3:1分离规律，该方法操作简单，无设备和仪器的特殊要求，为棉花转基因育种提供技术支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种遗传转化方法，特别涉及一种用农杆菌转染棉花花粉的遗传转化 和筛选方法。
技术介绍
基因工程技术可以突破物种间的遗传障碍，超越物种间的不亲和性，创造出人们 所需要的新品种，大大拓宽棉花遗传改良的途径。随着基因转化方法的深入和完善，众多方 法应用于棉花，如农杆菌介导法、花粉管通道法、基因枪法、显微激光法，以及农杆菌和基因 枪结合转化方法等。花粉管通道法是我国周光宇先生1978年提出的一套自花授粉后外源 DNA导入植物的转基因技术，该方法避开了棉花组织培养的体细胞胚胎体发生和植株再生 的障碍且操作简便，所需时间短。但不足是其转化机理不确定，转化效率低且不稳定。 因此，花粉管通道法结合农杆菌介导法，可以既不依赖于植物组织培养和诱导再 生植株再生等人工培养过程，同时又利用农杆菌对植物侵染的高效性优势，在植物基因转 化中备受研究工作者的青睐。Tjokrokusumo等用农杆菌真空渗透转染花粉方法成功转化矮 牵牛。在棉花中，Chen等用农杆菌浸渍柱头后再进行授粉，得到了 0. 46%?0. 93%的转化 率；李晓等和张燕红等分别用农杆菌真空渗透转化棉花花粉，然后用处理花粉对棉花授粉， 均获得了转基因植株；彭珍子通过农杆菌子房注射对棉花进行活体转化，在不同品种的棉 花中转基因效率平均达2. 78%。提高农杆菌转染棉花花粉的转化效率极其重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种用农杆菌转染棉 花花粉的遗传转化和筛选方法。通过对转染方法的改进极大的提高了转化效率。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种用农杆菌转染棉花花粉的遗传转化和 筛选方法，包括以下步骤： 1)配制农杆菌感染的花粉萌发培养基：花粉萌发培养基包含的组分为0. 5mMKN03， 2.7禮11^04，1.71111113803,0.511111%50 4.71120，1.511]\16八3，口117.5，质量浓度为40%?45% 的蔗糖；花粉萌发培养基配制后高压灭菌，然后分装获得液体培养基，封口膜（parafilm)密 封，4°C保存备用； 2)转化方法：挑取带有双元载体质粒pCB4_bar的农杆菌，在YEP液体培养基中 培养，培养条件为摇床转速180?220rpm，28°C，振荡培养过夜；当菌液的0D_值为0. 6? 0. 8时，3000r/min离心lOmin收集菌体，重悬于步骤2)配制好的花粉萌发培养基中；收集 新鲜的棉花花粉浸泡于该菌液中，花粉浓度为l〇〇g/L，加入1%。体积比的Tween-20 (表面活 性剂）并抽真空，压力_80Pa，持续20min ;将浸过农杆菌的花粉用毛笔涂抹于去雄过的棉花 柱头，然后在柱头上套上一端封闭的麦管；待棉花种子成熟后，收集棉花种子； 3)转基因棉苗的筛选：将步骤2)获得的棉花种子播种后，待棉花幼苗进入三片真 叶期时，采用〇.3ml/L浓度的Basta溶液进行涂抹筛选，3d后观察涂抹叶片未出现坏死斑点 的植株，确认为转化成功的转基因棉苗。 步骤1)中所述的高压灭菌优选为121°C条件下灭菌20分钟； 步骤2)所述的YEP液体培养基的制备为：取胰蛋白胨10g;酵母提取物lg; MgS0 40. 5g和鹿糖5g定溶至1L水中，用5mmol/L NaOH调pH至7. 0,高压灭菌。 步骤2)中所述的重悬，采用100mL菌液（0D600 = 0? 6?0? 8)在3000r/min离心 lOmin后重新悬浮于100mL花粉培养基。 步骤2)中所述的双元载体质粒pCB4-bar为包括抗除草剂基因bar，CaMV35S启动 子及NOS终止子的pCB4载体。外源基因bar基因，来源于吸水链霉菌（streptomyces hy hygroscopieus)，对除草剂PPT(phosphinothricin)具有抗性。质粒的具体信息参见文献： 唐微等转Bar基因抗除草剂水稻的培育，湖北农业科学，2007, 46 (4) :488-490。 步骤2)中所述的农杆菌优选为农杆菌菌株LBA4404 ; 步骤2)中所述的新鲜的棉花花粉优选为陆地棉'Coker312'自交品系的花粉；所 述的新鲜的棉花花粉是指将头天傍晚采集的次日将开花的花蕾，置4°C冰箱中保存，于次日 7?8时取已自然散粉的花粉用于转化；或当天12?14小时开的新鲜受体材料的花粉。 步骤2)中所述的花粉涂抹去雄过的棉花柱头优选在晴朗天气的上午10 :00? 10:30的时间进行涂抹。 步骤3)中所述的Basta的商品名为Finale，有效成份为5. 78 %的草铵膦 (glufosinate-ammonium)〇 本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果： 本专利技术的花粉粒农杆菌转染法，能巧妙地利用了植物自身的生殖系统--花粉管 通道作为载体，从而克服了多数转化系统转化受体再生难的技术障碍。结果表明，本专利技术优 化的农杆菌感染花粉的转化率可达1. 3%，获得的转化后代植株Basta抗性分离符合3:1 分离规律，该方法操作简单，无设备和仪器的特殊要求。花粉粒农杆菌转染法避免了传统的 棉花子房注射法导致的裸露DNA整合机制不很明确的缺点，所需要的转化时间与子房注射 DNA法大致相同，重复性强，是一种经济有效的棉花外源基因转化的实用方法。 本专利技术的农杆菌转染花粉法是用农杆菌真空渗透感染刚萌发的花粉，再将感染后 的花粉授粉于柱头，通过花粉管途径将遗传物质传递给子代，获得转基因植株。本实验以抗 除草剂基因bar作为目的基因，通过农杆菌转染花粉法转化棉花，同时优化部分影响转化 的因素，筛选出适合转化的最适条件，为棉花转基因育种提供技术支持。 【附图说明】 图1是质粒pCB4-bar的物理图谱； 图2是不同蔗糖浓度对花粉生活力的影响图； 图3是抗除草剂（Basta)涂抹转化和非转化植株叶片抗性和敏感反应图；其中a 为转bar基因棉；b为对照（Basta涂抹处理后7d); 图4是转bar基因植株的PCR检测电泳图；其中：泳道M:DL2000marker ;泳道P : 阳性对照；泳道CK :阴性对照；泳道1-22 :花粉粒农杆菌转染法获得的转化植株。 【具体实施方式】 下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限 于此。 农杆菌菌株和受体材料： 本研究所用的菌株为带有双元载体质粒pCB4_bar的农杆菌菌株LBA4404,该质粒 包括抗除草剂基因bar，CaMV35S启动子及N0S终止子（质粒结构图见图1)。受体材料为 陆地棉'Coker312'自交品系。 上述的双元载体质粒pCB4_bar的外源基因bar基因来源于吸水链霉菌 (streptomyceshyhygroscopieus)，对除草剂PPT(phosphinothricin)具有抗性。质粒的 具体信息参见文献：唐微等转Bar基因抗除草剂水稻的培育，湖北农业科学，2007, 46 (4): 488-490。 BLOCKMD,BOTTERMANJ,VANDEWIELEM,etal.Engineeringher本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用农杆菌转染棉花花粉的遗传转化和筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：1)配制农杆菌感染的花粉萌发培养基：花粉萌发培养基包含的组分为0.5mMKNO3，2.7mM MnSO4，1.7mM H3BO3，0.5mM MgSO4·7H2O，1.5μM GA3，pH 7.5，质量浓度为40％～45％的蔗糖；花粉萌发培养基配制后高压灭菌，然后分装获得液体培养基，封口膜密封，4℃保存备用；2)转化方法：挑取带有双元载体质粒pCB4‑bar的农杆菌，在YEP液体培养基中培养，培养条件为摇床转速180～220rpm，28℃，振荡培养过夜；当菌液的OD600值为0.6～0.8时，3000r/min离心10min收集菌体，重悬于步骤2)配制好的花粉萌发培养基中；收集新鲜的棉花花粉浸泡于该菌液中，花粉浓度为100g/L，加入1‰体积比的Tween‑20并抽真空，压力‑80Pa，持续20min；将浸过农杆菌的花粉用毛笔涂抹于去雄过的棉花柱头，然后在柱头上套上一端封闭的麦管；待棉花种子成熟后，收集棉花种子；3)转基因棉苗的筛选：将步骤2)获得的棉花种子播种后，待棉花幼苗进入三片真叶期时，采用0.3ml/L浓度的Basta溶液进行涂抹筛选，3d后观察涂抹叶片未出现坏死斑点的植株，确认为转化成功的转基因棉苗。...
【技术特征摘要】
1. 一种用农杆菌转染棉花花粉的遗传转化和筛选方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 配制农杆菌感染的花粉萌发培养基：花粉萌发培养基包含的组分为0. 5mMKN03， 2.7禮11^04，1.71111113803,0.511111%50 4.71120，1.511]\16八3，口117.5，质量浓度为40%?45% 的蔗糖；花粉萌发培养基配制后高压灭菌，然后分装获得液体培养基，封口膜密封，4°C保存 备用； 2) 转化方法：挑取带有双元载体质粒pCB4-bar的农杆菌，在YEP液体培养基中培养， 培养条件为摇床转速180?220rpm，28°C，振荡培养过夜；当菌液的0D6(I(I值为0? 6?0? 8 时，3000r/min离心lOmin收集菌体，重悬于步骤2)配制好的花粉萌发培养基中；收集新鲜 的棉花花粉浸泡于该菌液中，花粉浓度为l〇〇g/L，加入1%。体积比的Tween-20并抽真空，压 力-80Pa，持续20min ;将浸过农杆菌的花粉用毛笔涂抹于去雄过的棉花柱头，然后在柱头 上套上一端封闭的麦管；待棉...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋玉蓉，祝水金，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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