使用gB基因启动子的重组疱疹病毒制造技术

一种重组疱疹病毒，它含有一个外源基因表达盒，其中来自疱疹病毒的ｇＢ基因启动子被用作表达外源基因的启动子。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的重组病毒，它可以在动物细胞或动物体中表达外源基因，并且在避开宿主免疫系统的攻击的同时，甚至在母体抗体存在的情况下也可以在相当长的一段时间内持续感染以延长抗原的刺激作用，从而提供了一种甚至对具有母体抗体的常规动物有效的疫苗。本专利技术还涉及一种使用上述重组病毒的用于动物的多价活性疫苗。本专利技术进一步涉及一种重组病毒载体，它可被用于活体内的药物递送系统(DDS)，以生产生理活性物质，例如激素或促细胞分裂素。专利技术背景病毒载体对接种的有效性，以及它作为活体基因导入系统已被广泛研究。特别是在家禽工业中，对痘病毒，尤其是鸟痘病毒的研究已经取得了长足的进展。在这种情况下，为了开发一种更有效的载体，本专利技术人对由1型马立克氏(Marek’s)病毒(以下也称作“MDV1”，一种鸟类疱疹病毒)制备载体进行了研究，并且报告了其多项结果。例如，本专利技术人已经研究了MDV1基因组上20多个位点，结果鉴别出US10基因作为外源基因的插入位点，可以稳定地保留外源基因，但并不减弱疫苗对马立克氏病的效果(日本专利申请4-205933(日本专利出版物6-22757)；第四届国际马立克氏病讨论会(1992)，阿姆斯特丹；疫苗，1994，第12卷，953-957页)。一种将新城病毒的F蛋白基因插入到US10基因中的重组病毒，作为疫苗在SPF小鸡中显示了充分的效果，该效果在接种后至少持续24周(第四届国际马立克氏病讨论会(1992)，阿姆斯特丹)。已经证明该重组病毒甚至在有母体抗体的小鸡中，对马立克氏病和新城病都有预防效果，但预防效果多少低于在SPF小鸡中。即，该重组病毒在SPF小鸡中显示对新城病有100％的预防效果，然而在具有母体抗体的野生鸡(fieldchicken)中显示出低一些的效果，例如70-90％的水平(《(马立克氏病毒分子生物学研究组当前进展》，1995，佛罗里达)。推测效果的降低归因于当野生鸡被该重组病毒免疫的同时，通过母体抗体对新城病和马立克氏病的作用，抑制了重组病毒在体内的生长。专利技术公开如上所述，当一种包含重组病毒的活性疫苗被接种到具有母体抗体的动物中时，就产生了问题，即该病毒被被宿主免疫系统(如母体抗体)消除或其生长被抑制。因此，需要一种改进的重组病毒，在避开免疫系统的攻击的同时，它可以在相当长的一段时间内保持活性疫苗的特性，并能够持续提供抗原的刺激作用。为了解决上述问题，本专利技术人注意到了源于MDV1的启动子，并且克隆了几种源于马立克氏病毒(以下也称作“MDV”)基因组的假定启动子基因。用这些启动子基因，本专利技术人进行了在包含外源基因的重组病毒中表达该外源基因的实验。结果发现，在本专利技术人克隆的几种启动子基因中，从糖蛋白B(以下也称作“gB”)基因(一种与单纯疱疹病毒gB基因同源的基因)中获得的启动子，在外源基因(例如新城病毒F蛋白(以下也称为“NDV-F”))的表达方面显示了特别出色的效果，而且，在动物体内产生了比预期的好得多的免疫效果。即，在培养的细胞中，用该启动子表达的F蛋白的量明显低于用常规启动子(例如SV40启动子)的重组病毒表达的量，但无论如何，与期望的相比，在动物(小鸡)体内观察到了相当高的免疫原性，即有该启动子的重组病毒与常规的重组病毒相比，对新城病显示出了更多的预防效果，甚至在用它免疫具有母体抗体的野生鸡时，仍能稳定地表现出95％以上的预防效果，具有母体抗体的动物的有效免疫仍是正在解决的问题。附图的简要描述附图说明图1是克隆的假定gB启动子片段的示意图。图2显示了gB基因上游的核苷酸序列，以及用于核苷酸序列测定和PCR引物的每一个引物的位置。图3显示了用gB启动子表达NDV-F蛋白的插入载体质粒(pKA4BPF和pKA4BNF)的构建。图4显示了在US10BPF和US10BNF中插入gB启动子和NDV-F基因的理论方案，以及用于构建插入载体质粒的片段A4的位置。图5显示了用重组病毒US10BPF和US10BNF感染后，从CEF中提取的DNA的限制性酶PstI的切割产物的Southern杂交的结果，用从gB启动子中获得的片段P或片段A4作探针。图6是用重组病毒US10BPF、US10BNF或US10BLF接种的以及未被接种的小鸡在ELISA中抗F抗体滴度变化的曲线图。图7是用重组病毒US10BPF接种的小鸡在ELISA中抗F抗体滴度变化的曲线图。实施本专利技术的最佳方式考虑到上述免疫实验中获得的出色的预防效果，本专利技术使用的由疱疹病毒获得的gB启动子据推测具有如下特性即，无论血液中是否存在可以对MDV诱发高抗体滴度的中和抗体，马立克氏病的活性疫苗病毒将在小鸡体内持续感染。虽然该病毒如何绕过宿主免疫系统以持续诱导抗原的刺激作用的机理是未知的，但一种可能性是潜伏感染的病毒存在的组织不同于抗原(例如gB)表达的组织。即推测在马立克氏病毒潜伏感染的组织中，免疫系统的目标抗原不被表达，结果，病毒可以避开宿主免疫系统的防卫。推测这样的潜伏病毒经常被激活，通过感染另一个组织，并在其中表达病毒抗原来刺激免疫系统，从而诱导抗体的大量产生。gB是一种诱导抗病毒的中和抗体产生的糖蛋白，其表达被其本身的gB基因启动子所控制，该启动子在本专利技术中被成功地克隆。据推测，虽然抗gB的抗体(例如中和抗体)的产生在MDV感染的小鸡中被诱发，但是MDV避开了中和抗体，并且持续感染以引起抗原刺激作用，从而产生高抗体滴度。即，推测gB启动子在特殊的细胞中表达gB，但不在MDV潜伏的细胞中表达，结果MDV持续感染，同时避开了宿主的免疫系统。相应地，通过使用表达新城病毒F蛋白的gB启动子，F蛋白的表达同样被gB启动子所控制，结果，重组病毒获得了持续感染，同时避开宿主免疫系统攻击的特性。相反，对于本专利技术人迄今构建的插入不同重组病毒中的从SV40获得的启动子，虽然启动子自身的活性是很高的，但是重组病毒在可能潜伏感染的细胞表面表达F蛋白，结果，这些病毒被宿主的免疫系统作为攻击目标，并因此很容易地在活体中被排除，其原因在于缺乏上述的控制机制。在这样的情况下，尤其是存在母体抗体的情况下，推测由于被免疫系统更快速地排除，这些重组病毒不能充分繁殖。与MDV-gB同源的其它的糖蛋白也存在于许多疱疹病毒中，并且被认为是负责预防感染的抗原(R.Eberl等，医学病毒学杂志，卷27309-316页，(1989))。考虑到这一点，对于用作载体的马立克氏病毒和其它疱疹病毒，使用gB基因启动子被认为是对有效地表达感兴趣的外源基因以及长时间保持疫苗功效非常有效的。在优选的实施方案中，有效的重组疱疹病毒是用从疱疹病毒中获得的gB启动子基因制备的(即，该疱疹病毒本身所含有的gB启动子基因)。除MDV之外，这样的疱疹病毒包括saimiri疱疹病毒R.C.Desrosiers等，分子和细胞生物学，卷5，2796-2803页，(1994)；假狂犬病毒K.L.Glazenburg等，病毒学杂志，卷69，189-197页，(1995)；1型单纯疱疹病毒(以下称作“HSV1”)H.J.Federoff等，美国国家科学院院刊，卷59，1636-1640页，(1992)；2型单纯疱疹病毒(以下称作“HSV2”)J.B.David等，病毒学，卷155，322-333页，(1986本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：园田宪悟，坂口正土，松尾和夫，滨田福三郎，
申请(专利权)人：财团法人化学及血清疗法研究所，
类型：发明
国别省市：