一种肝素测定的试剂盒制造技术

本发明专利技术属于医学体外诊断领域，具体涉及一种肝素测定的试剂盒，包含猪FⅩa、acharan sulfate裂解酶和发色底物。本发明专利技术所述试剂盒所述FⅩa由猪血浆制备而得，解决血浆来源，适合中国国情，制备方便，降低成本；本发明专利技术所述试剂盒采用一条标准曲线可用于多种肝素类药物的检测，无需制定多条不同肝素类药物的标准曲线，操作简便；本发明专利技术所述试剂盒检测血浆样品无需稀释，检测结果灵敏度高，稳定性好，精确度高。

【技术实现步骤摘要】
一种肝素测定的试剂盒
本专利技术属于医学体外诊断领域，具体涉及一种肝素测定的试剂盒，尤其是涉及一种发色底物法(一步法)检测肝素活性的肝素测定试剂盒。
技术介绍
肝素是一种酸性黏多糖，由分布在肠黏膜的肥大细胞合成。正常人血液中含量极少，生理情况下其抗凝作用很小。它可通过加速抗凝血酶、HCⅡ起抗凝作用，对TFPI和蛋白C系统也有影响。天然肝素是不均一的，其分子量在3-57kD之间(王振义.血栓与止血基础理论与临床[M].第三版.上海：上海科学基础出版社，2004:119-119)。临床上把肝素作为抗凝剂药物而广泛使用，主要用于血栓性疾病的治疗及心血管手术上、血液透析、体外循环等过程的抗凝处理。肝素是临床医学中一种最常用的抗凝治疗剂，肝素类药物在抗血栓药物中占有极大的市场份额，其中又以低分子肝素类药物占主导。作为药物，肝素活性功能的精确检测无论对于生产过程的质量控制还是临床治疗中患者的动态监控均具有重要的意义。目前肝素测定方法主要为凝固法和发色底物法(US4234682、US4948724、US5308755A、CN104048931A、CN103063592A、CN103323416A；TenCH,LampingRJ,HennyCP,etal.Automatedamidolyticmethodfordeterminingheparin,aheparinoid,andalow-Mrheparinfragment,basedontheiranti-Xaactivity[J].ClinicalChemistry,1984,30(6):860-864)。凝固法是较为传统的肝素活性测定方法，其操作繁琐、专属性差、耗时费力、精确度低，而发色底物法利用肝素糖链中含有与抗凝血酶高亲和的五糖结构域，能够特异性结合体内抗凝血酶(AT)，形成肝素-抗凝血酶复合物，肝素-抗凝血酶复合物能够抑制活化的凝血因子Ⅹ(或凝血因子Ⅱ)水解发色底物的显色反应的基本原理，具有灵敏度高、操作简便、特异性强的特点。研究显示在抗Ⅹa因子相互作用过程中，只需含肝素核心五糖结构域糖链激活AT进而达到抗凝血的目的；在抗Ⅱa因子相互作用过程中不仅需要肝素包含有核心五糖结构域，还要包括至少十八个单糖组成的糖链(LaneDA,DentonJ,FlynnAM,etal.Anticoagulantactivitiesofheparinoligosaccharidesandtheirneutralizationbyplateletfactor4.[J].BiochemicalJournal,1984,218(3):725-732)。目前国际上已有用发色底物法取代血液凝固法的趋势。在第六次肝素国际标准品协作标定中，WHO已将抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子活性测定作为推荐使用的标定方法，美国药典第37版以及欧洲药典第8.3版均采用该方法测定肝素效价。2015年版的《中国药典》肝素效价的测定方法也将凝固法改为发色底物法测定肝素抗Ⅱa因子活性。临床上使用试剂盒测定以有效地反应肝素在血浆中的浓度，目前市面上有许多商品化的肝素测定试剂盒出售，绝大多数产品为发色底物法且多为进口产品。市面上采用发色底物法的肝素测定试剂盒有两种，一种是两步法，该法不依赖于血浆中的AT含量，检测样品血浆中总肝素含量。该法的肝素测定试剂盒有两类，一类市售试剂盒中包含抗凝血酶(AT)、牛FⅩa或者人FⅩa、缓冲液和发色底物，如Sekisui公司的Heparin(Anti-FⅩa)、IL公司的Heparin-0020009400、Siemens公司的Heparin、Stago公司的Heparin及Aniara公司的BiophenHeparinanti-Ⅹa(2stages)等，另一类市售试剂盒中包含抗凝血酶(AT)、牛FⅡa、缓冲液和发色底物，如Sekisui公司的Heparin(Anti-FⅡa)及Aniara公司BiophenHeparinanti-Ⅱa(2stages)等，此类试剂无法用于检测低分子量肝素(LMWH)。另外一种是一步法，该法市售试剂盒中包含牛FⅩa和发色底物，如IL公司的LiquidHeparin-0020300100，AniaraBiophenHeparinLRT(液体)及BiophenHeparin(冻干)等，该法检测样品血浆中起抗凝作用的肝素。我国对血液的管理比较严格，人血来源受限，且牛FⅩa的制备方法简便且由来已久，因而专利报道中优选的FⅩa来源以及市售肝素测定试剂盒(发色底物法)中FⅩa组分绝大部分来自牛血。然而，相比牛血资源，我国猪血资源更为丰富，利用率却不高。此外，临床上应用的肝素类药物种类较多，目前发色底物法测定肝素时需要依据不同种类的肝素制定相应的新的标准曲线。这一定程度上降低了肝素测定试剂盒(发色底物法)的简便性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对目前现有肝素测定试剂盒存在的不足，提供一种发色底物法(一步法)检测肝素活性的试剂盒，该试剂盒一定程度下解决血浆的来源，更符合中国国情，同时制备方便，操作简便，具有较高的灵敏度和稳定性，检测结果精确度高，市场竞争优势强。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供如下技术方案。一种肝素测定的试剂盒，包含猪FⅩa、acharansulfate裂解酶和发色底物。其中，所述猪FⅩa为活化猪血浆凝血因子Ⅹ，可由本领域技术人员通过已知的分离纯化方法从猪血浆中提取纯化制备得到,如参考ChurchWR等人的文献(ChurchWR,MannKG.AsimplepurificationofhumanFactorXusingahighaffinitymonoclonalantibodyimmunoadsorbant[J].ThrombosisResearch,1985,38(4):417-424.)。本专利技术所述试剂盒中的所述acharansulfate裂解酶与肝素酶Ⅱ性质相似，能够修饰和剪切糖胺聚糖链，对肝素及硫酸肝素均有一定的裂解作用，可由本领域技术人员通过已知的分离纯化方法从Bacteroidesstercoris制备而得，如参考KimBT等人的文献(KimBT,HongSW,KimWS,etal.Purificationandcharacterizationofacharansulfatelyases,twonovelheparinases,fromBacteroidesstercoris,HJ-15[J].EuropeanJournalofBiochemistry,2001,268(9):2635-2641.)。在发色底物法检测肝素的活性的过程中，发色底物作为FⅩa底物，要求具有较高的敏感性和较好的水溶性，才能有效提高检测的灵敏度，保证检测结果的准确性。作为优选，本专利技术所述试剂盒中的所述发色底物为Suc-Ile-Glu-(γ-Piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl、Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·HCl或Bz-Ile-Glu(-OR)-Gly-Arg-pNA·HCl。更优选为Suc-Ile-Glu-(γ-Piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl。在一些实施方案中，所述试剂盒包含R1试剂和R2试剂，所述R1试剂包含猪F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝素测定的试剂盒，其特征在于，包含猪FⅩa、acharan sulfate裂解酶和发色底物。

【技术特征摘要】
1.一种肝素测定的试剂盒，其特征在于，包含猪FⅩa、acharansulfate裂解酶和发色底物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发色底物为Suc-Ile-Glu-(γ-Piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl、Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·HCl或Bz-Ile-Glu(-OR)-Gly-Arg-pNA·HCl。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，包含R1试剂和R2试剂，所述R1试剂包含猪FⅩa，所述R2试剂包含acharansulfate裂解酶和发色底物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂和R2试剂为冻干试剂，其中所述R1试剂由猪FⅩa、缓冲剂、稳定剂和赋形剂制成，所述R2试剂由acharansulfate裂解酶、发色底物、缓冲剂、硫酸葡聚糖、稳定剂和赋形剂制...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢永华，
申请(专利权)人：上海太阳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31