Ｃ－反应蛋白（Ｈｓ－ＣＲＰ）测定试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种Ｃ－反应蛋白（Ｈｓ－ＣＲＰ）测定试剂盒，属于试剂盒及其检测方法领域，由ＰＢＳ缓冲液、ＰＥＧ、抗体致敏胶乳、稳定剂、表面活性剂组成，首先采用抗体制备技术，筛选出高特异高亲和力的ＣＲＰ抗体，然后采用胶乳微粒增强技术，通过特殊的化学交联剂把该抗体连接到自己合成的聚苯乙烯胶乳颗粒的表面，制备成体积扩大了近百倍具有免疫活性的免疫胶乳，本发明专利技术试剂盒能快速有效稳定的检测出人血清中Ｃ－反应蛋白（ＣＲＰ）的含量，及时发现人体中的心血管疾病和炎症。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测用试剂盒，尤其涉及到一种用于测定人血清中C-反应蛋白 (CRP)含量的C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒。
技术介绍
近年研究发现，心血管疾病患者体内常常伴有持续的低水平的炎症，CRP为急性期 蛋白的一种，在机体出现炎症时，CRP在数小时内迅速升高，CRP含量愈多，表明病变活动度 愈高，炎症恢复过程中，若CRP呈阳性，预示仍有突然出现临床症状的可能性，病变消退时 又迅速降到正常水平，临床实验表明，CRP作为一种炎症标记物和心血管疾患的相关性要远 远高于其他已知的项目，因此对低水平的CRP的检测已经发展成为衡量患者心血管疾病危 险性的重要指标。
技术实现思路
本专利技术提供了一种采用胶乳微粒增强技术，改造传统的免疫透射法试剂的C-反 应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒，适用于各种类型的半自动、全自动临床生化分析仪，用于测 定人血清中C-反应蛋白(CRP)含量，具有检测灵敏度高、稳定性高等优异性能。本专利技术所采用的技术方案如下C_反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒，主要流程包 括CRP抗体检验，纯化蛋白，蛋白修饰，胶乳的合成，包被与封闭，增浊剂配置，分装；首先 采用抗体制备技术，筛选出高特异高亲和力的CRP抗体，然后采用胶乳微粒增强技术，通过 特殊的化学交联剂把该抗体连接到自己合成的聚苯乙烯胶乳颗粒的表面，制备成体积扩大 了近百倍具有免疫活性的免疫胶乳，从而提高反应的灵敏度及检测结果的准确度。本专利技术试制的关键步骤如下1、纯化蛋白1. 1将血清用0.2M醋酸溶液1 1稀释；缓慢搅拌下滴加血清和醋酸总体积 X0. 025ml的辛酸，室温下搅拌30min ；缓慢搅拌下滴加上清和PBS总体积X0. 818ml的饱和 硫酸铵，室温搅拌30min ； IOOOOrpm离心lOmin，弃上清，以沉淀形式保存于_20°C。1. 2在进行层析纯化之前，先将上述沉淀物取出，用生理盐水复溶，测定蛋白含量， 以280nm波长比色，读出OD值，除以IgG的消光系数1. 4后得到蛋白含量，单位为mg/ml。1.3将蛋白用生理盐水稀释到10mg/ml左右后方能上柱；打开用于层析的 sephacryls-300柱，把上面的生理盐水吸净后，将蛋白溶液沿壁轻轻加入；待蛋白溶液全 部进入柱床后，用生理盐水洗净壁上残留，然后轻轻加入生理盐水至高于柱床表面3cm处， 盖上层析柱上盖，拧紧并打开进水管道，用分部收集器收集；将收集到的蛋白溶液在紫外分 光光度计280nm波长下进行检测读取OD值。1. 4整个蛋白分离过程呈现第一个为小峰，第二个为大峰(主峰)，主峰高度与二 峰之间的谷底高度OD值的比值彡2为正常；合并主峰(IgG峰)≥2的部分，混勻，用生理 盐水做适当倍数稀释，测定计算蛋白含量，计算公式为0D值*稀释倍数/1. 4，计算结果即为该溶液的IgG浓度。2、蛋白修饰根据蛋白含量20mg，用分析天平称取EDC66mg，将EDC加入到待修饰 的蛋白溶液中。3、胶乳的合成水浴箱内加入纯化水1500ml，加入过硫酸钾1. 65g，SDS16ml，搅拌 器内充氮，搅拌溶解不少于6小时，再加入150ml苯乙烯，用脱脂棉过滤。4、包被、封闭4. 1量取胶乳400ml (16胶乳)，置高速离心机上离心:12000rpm离心，35分钟；4. 2弃上清，留沉淀，沉淀物用生理盐水分散至800ml ；4. 3将已修饰的蛋白溶液加入到胶乳溶液中混勻，置磁力搅拌器搅拌；4. 4将已包被好的胶乳，置告高速离心机，12000rpm离心，25分钟；4. 5弃上清，留沉淀，沉淀物用1 %牛血清白蛋白2000ml，封闭，重复1次，2 8 °C保存待用，用PB4000ml清洗，重复4次，12000rpm离心，取沉淀用胶乳稀释液稀释到 2000ml ；4. 6调整灵敏度，加胶乳稀释液，稀释成胶乳工作液；4. 7置冷库2-8 °C保存。5、增浊剂配置5. 1配置0. 02M的磷酸缓冲溶液；5. 2在IOOOml磷酸缓冲溶液中加入Iml吐温-20。6、分装用灌装恒流泵按包装规格分装。本专利技术所采用的检测技术原理是将抗体定向锚定在胶乳表面，血清中的CRP与 试剂中相应抗体在液相中结合成抗原抗体复合物，产生浊度变化，胶乳试剂可以特异的增 大该浊度变化，增大试剂的灵敏度，该浊度变化的高低与样本中CRP的含量成正比，测定该 浊度，与标准血清比较，即能得出样本血清中CRP的含量。本专利技术由于采用了以上独特的技术方案，本专利技术具有以下的有益效果1、采用了胶乳增强技术的应用创新，解决了传统的免疫透射比浊法不够灵敏和精 确的问题，灵敏度更高；2、进行了工艺方法的创新，生产制备工艺更加简单，解决了传统方法在分离抗体 的过程中无法完全去除蛋白酶的问题，使试剂的稳定性大大提高；3、检测范围更宽，检测的线性范围达到0. 1 30mg/L, r彡0. 99。附图说明图1为本专利技术的工艺流程图。 具体实施例方式下面结合附图对本专利技术作进一步的详细说明参照附图1，C-反应蛋白(Hs-CRP)测定试剂盒，由PBS缓冲液、PEG、抗体致敏胶 乳、稳定剂、表面活性剂组成，其制备主要流程包括CRP抗体检验，纯化蛋白，蛋白修饰，胶 乳的合成，包被与封闭，增浊剂配置，分装；首先采用抗体制备技术，筛选出高特异高亲和力 的CRP抗体，然后采用胶乳微粒增强技术，通过特殊的化学交联剂把该抗体连接到自己合4成的聚苯乙烯胶乳颗粒的表面，制备成体积扩大了近百倍具有免疫活性的免疫胶乳，从而 提高反应的灵敏度及检测结果的准确度。本专利技术试制的主要步骤如下1、纯化蛋白1. 1将血清用0.2M醋酸溶液1 1稀释；缓慢搅拌下滴加血清和醋酸总体积 X0. 025ml的辛酸，室温下搅拌30min ；缓慢搅拌下滴加上清和PBS总体积X0. 818ml的饱和 硫酸铵，室温搅拌30min ； IOOOOrpm离心lOmin，弃上清，以沉淀形式保存于_20°C。1. 2在进行层析纯化之前，先将上述沉淀物取出，用生理盐水复溶，测定蛋白含量， 以280nm波长比色，读出OD值，除以IgG的消光系数1. 4后得到蛋白含量，单位为mg/ml。1.3将蛋白用生理盐水稀释到10mg/ml左右后方能上柱；打开用于层析的 sephacryls-300柱，把上面的生理盐水吸净后，将蛋白溶液沿壁轻轻加入；待蛋白溶液全 部进入柱床后，用生理盐水洗净壁上残留，然后轻轻加入生理盐水至高于柱床表面3cm处， 盖上层析柱上盖，拧紧并打开进水管道，用分部收集器收集；将收集到的蛋白溶液在紫外分 光光度计280nm波长下进行检测读取OD值。1. 4整个蛋白分离过程呈现第一个为小峰，第二个为大峰(主峰)，主峰高度与二 峰之间的谷底高度OD值的比值彡2为正常；合并主峰(IgG峰)彡2的部分，混勻，用生理 盐水做适当倍数稀释，测定计算蛋白含量，计算公式为0D值*稀释倍数/1. 4，计算结果即 为该溶液的IgG浓度。2、蛋白修饰根据蛋白含量20mg，用分析天平称取EDC66mg ；将EDC加入到待修饰 的蛋白溶液中。3、胶乳的合成水浴箱内加入纯化水1500ml，加入过硫酸钾1. 65g，SDS 16ml，搅 拌器内充氮，搅拌溶解不少于6小时，再加入150ml苯乙烯，用脱脂棉过滤。4、包被本文档来自技高网...

【技术保护点】
Ｃ－反应蛋白（Ｈｓ－ＣＲＰ）测定试剂盒，由ＰＢＳ缓冲液、ＰＥＧ、抗体致敏胶乳、稳定剂、表面活性剂组成，其特征在于：采用抗体制备技术，筛选出高特异高亲和力的ＣＲＰ抗体，然后采用胶乳微粒增强技术，通过特殊的化学交联剂把该抗体连接到自己合成的聚苯乙烯胶乳颗粒的表面，制备成体积扩大了近百倍具有免疫活性的免疫胶乳，其制备的主要步骤包括：纯化蛋白，蛋白修饰，胶乳的合成，包被、封闭，增浊剂配置，分装。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建华，
申请(专利权)人：上海捷门生物技术合作公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]