本发明专利技术公开了一种肌红蛋白免疫吸附剂，它由固相载体和与之偶联的肌红蛋白多克隆抗体组成，所述肌红蛋白多克隆抗体为以钥孔虫戚血蓝蛋白和抗原肽交联形成的复合物为免疫原得到的多克隆抗体，所述抗原肽的氨基酸序列如序列表SEQ?ID：No.5所示。本发明专利技术还公开了以上述的肌红蛋白免疫吸附剂为填料的肌红蛋白免疫吸附柱，以及含有该肌红蛋白免疫吸附柱的肌红蛋白免疫吸附装置和急救工具包。本发明专利技术的免疫吸附剂及装置立足于便捷的血液灌流治疗模式，可实现肌红蛋白高度特异性的吸附，尤其适合应用于横纹肌溶解的现场救治。与血液透析或滤过模式相比较，全血灌流模式水电消耗较小，更易实现，更符合灾难事故现场救治的需要。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种免疫吸附剂及含有该吸附剂的免疫吸附装置，特别是可应用于横纹肌溶解的现场急救的免疫吸附装置。
技术介绍
横纹肌溶解可以导致急性肾损伤，肌红蛋白是致病的关键蛋白，能够导致肾小管上皮细胞的凋亡。清除血中的肌红蛋白，是治疗横纹肌溶解的有效方法。肌红蛋白多肽链的疏水侧链大都在分子内部，形成一袋形空穴，亲水侧链多位于分子表面，因此其水溶性较好，可经肾小球自由滤过。在异常增高时，通常采用血液透析或血液滤过进行治疗。但传统的血液透析对肌红蛋白清除不足，而采用血液滤过，特别是高通量血滤可以达到较好的清除效果。但在特殊条件下，如地震、泥石流、战争、大型事故的现场，常因存在交通障碍、电力中断、供水设施破坏等，使血液透析等水电消耗量较大的治疗手段在灾难现场无法展开实施，从国际上几次大地震的文献报道，以及国内汶川大地震的实际抢救经验来看，许多伤员因为在现场没有能够展开的有效救治设施，而在转往后送途中或之后死亡。因此，开发能在灾害现场有效展开的救治模式，早期快速清除血液中高浓度的肌红蛋白，是救治的关键。血浆分离是非常有效的治疗模式，但因为血浆处理量有限，总清除量不高。尝试直接对全血灌流吸附或双重血浆滤过吸附是很有前景的治疗模式。而在现场，全血灌流更加可行。它是一种基础的血液净化模式，利用吸附原理，将血液循环的毒素清除体外。它的体外循环相对简单，仅需要一个动力泵，容易建立，最适合在现场急救中应用。在适当情况下， 甚至可以不用动力泵，靠伤员的动静脉压力差进行，更便于现场展开。本专利技术立足于血液灌流的治疗模式，利用抗原抗体特异性结合的吸附原理，构建免疫吸附装置，实现对肌红蛋白特异的吸附清除。关于肌红蛋白吸附清除的文献较少， Kuntsevich等对商品化的吸附器X-Sorb进行了肌红蛋白吸附测试，发现吸附率尚好，但该吸附器并非专为肌红蛋白设计，不能实现肌红蛋白特异性的清除，可能会影响其它血液成分。本研究提出以抗体为配基构建免疫吸附装置的肌红蛋白特异性清除方法，尚无文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有优良的对肌红蛋白特异性吸附清除作用的免疫吸附剂，以及含有该免疫吸附剂且大大减少对水电能源的依赖的、适用于横纹肌溶解的现场急救的肌红蛋白免疫吸附装置。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种肌红蛋白免疫吸附剂，它由固相载体和与之偶联的肌红蛋白多克隆抗体组成，所述肌红蛋白多克隆抗体为以钥孔虫戚血蓝蛋白和抗原肽交联形成的复合物为免疫原得到的多克隆抗体，所述抗原肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID :No. 5所示。如上所述的肌红蛋白免疫吸附剂，其中，所述固相载体为树脂载体。如上所述的肌红蛋白免疫吸附剂，其中，所述固相载体为D-380树脂载体。如上所述的肌红蛋白免疫吸附剂作为吸附柱填料的肌红蛋白免疫吸附柱。含有如上所述的肌红蛋白免疫吸附柱的肌红蛋白免疫吸附装置，它还包括导管、 血泵、空气监测器和静脉夹；所述导管依次连接血泵、肌红蛋白免疫吸附柱、空气检测器和静脉夹。含有如上所述的肌红蛋白免疫吸附柱的急救工具包，它还包括导管、血泵、血管穿刺针、手套、敷料、碘伏和电池。一种用于制备如上所述的肌红蛋白免疫吸附剂中的肌红蛋白多克隆抗体的免疫原，它是由钥孔虫戚血蓝蛋白和氨基酸序列如序列表SEQ ID :No. 5所示的抗原肽交联形成的复合物。如上所述的肌红蛋白免疫吸附剂，是按照步骤如下的制备方法制成的a.将所述树脂载体用乙醇浸泡2 4小时，反复洗涤后，稀盐酸浸泡30分钟，将树脂载体激活；b.将所述肌红蛋白多克隆抗体与激活的树脂载体混合，15rpm下旋转反应2小时， 使抗体与载体交联；c.反复洗去未与载体交联的抗体；d.加入pH8. 0的Tris缓冲液封闭过夜；e.用PBS洗涤，0. 02% g/mL的叠氮钠4°C存放。如上所述的肌红蛋白免疫吸附柱，是按照步骤如下的制备方法制成的a.将所述吸附柱填料用双蒸水浸泡M小时，置于双蒸水中成为吸附柱填料水悬液；b.将层析柱垂直固定于架台，关闭层析柱下方出口，由上口灌入所述吸附柱填料水悬液；c.吸附柱填料水悬液灌注完毕后，继续灌入双蒸水至液面到达层析柱的上口，插入柱芯至柱芯下端与填料上表面平齐，固定柱芯；d.层析柱上口接恒流泵，放开下口，以2mL/min的流速冲洗；e.反向冲洗多次至层析柱中无气泡；r改为正向冲洗，逐渐增加液相流速至20mL/min压柱；g.重新调整柱芯深度至其下端与填料上表面平齐后固定，再以20mL/min的流速恒流压柱30分钟；h.再调整柱芯深度至其下端与填料上表面平齐后固定，关闭下方出口，加入 20vt%乙醇备用。本专利技术的有益效果为1、本专利技术利用抗原和抗体特异性结合的原理，将抗体固定于载体上并装配吸附柱，当血液流经吸附柱时，血液中的肌红蛋白可以被吸附柱内载体上交联的抗体吸附，使得本专利技术的清除作用具有高度的特异性。2、由于本专利技术采用了简单的血液灌流模式，与传统的血滤模式相比较，对水电能源的依赖程度低，更适合灾难事故的现场救治需要。3、通过吸附实验检测本专利技术吸附效果上样蛋白量为4000. 02ug，流穿蛋白量为3090. 80ug，本专利技术肌红蛋白免疫吸附柱的平台期瞬时清除率为27. 95%，总清除量为 909. 23ug,总清除率为22. 73%。图7a中可见流穿液OD值较吸附前降低，而图7b中可见空白柱对肌红蛋白没有明显清除作用，流穿液与吸附前溶液的OD值无显著降低。可知免疫吸附柱对肌红蛋白有较好的清除作用。4、将肌红蛋白免疫吸附柱反复洗脱至基线平稳后，再测试其清除功能肌红蛋白样本总量为1971. 1 lug，流穿量为1136. 4!3ug，总清除量为834. 68ug，总清除率为42. 35%. 如图8所示，其总清除量与首次吸附的总清除量相近，说明该免疫吸附柱是可以复用的。5、比较免疫吸附柱对肌红蛋白等三种蛋白的吸附率，结果如表2所示，免疫吸附柱对肌红蛋白的吸附率显著高于其它两种蛋白，而另两种蛋白吸附率无显著差异。说明本专利技术免疫吸附柱的清除作用具有高度特异性。本专利技术与常规的血液透析或血液滤过治疗模式不同，它立足于便捷的血液灌流治疗模式，以肌红蛋白抗体做配基，交联树脂载体，装配肌红蛋白免疫吸附柱，可实现肌红蛋白高度特异性的吸附，尤其适合应用于横纹肌溶解的现场救治。与血液透析或滤过模式相比较，全血灌流模式水电消耗较小，更易实现，更符合灾难事故现场救治的需要。附图说明图1为检测纯化后抗体纯度的SDS-PAGE电泳图。图2为纯化后的抗体的Wfestern blot检测样本，图加为抗D-12抗体，图2b为抗 L-12抗体。图3为纯化后的抗体在肌溶解模型大鼠肾脏进行免疫组化的染色照片，图3a为抗 D-12抗体，图3b为抗L-12抗体。图4为D-380树脂孵育对血清电解质的影响的柱状图。 图5为408nm吸光度检测肌红蛋白浓度的标准曲线。图6为模拟体外循环的实验系统的模式图。图7为免疫吸附柱与空白柱吸附测试结果的比较，图7a为免疫吸附柱吸附测试结果，图7b为空白柱吸附测试结果。图8为免疫吸附柱洗脱再生后复用测试结果。图9为在3种不同吸附条件下、3种不同样本的FPLC检测结果，图9a_i分别示出吸附条件和样本的各种不同组合的检测结果。图10为本专利技术免疫吸附装置的构建模式图。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周建辉，陈香美，张利，孙雪峰，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：
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