一种向莴苣叶绿体中导入外源DNA的方法以及用于该方法的莴苣叶绿体DNA片段技术

本发明专利技术提供了一种向莴苣叶绿体中导入外源ＤＮＡ的方法，包括：利用ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示序列或者包括ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示序列３’端的不小于１ｋｂ的片段、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示序列或者包括ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示序列５’端的不小于１ｋｂ的片段、外源ＤＮＡ片段以及一种载体质粒来构建一个重组载体质粒，并使插入到载体质粒上的外源ＤＮＡ片段位于所述的两个片段之间；利用所构建的重组载体质粒ＤＮＡ转化莴苣细胞；培养转化的细胞成为植株。本发明专利技术还提供了用于该方法的莴苣叶绿体ＤＮＡ片段。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种向莴苣叶绿体中导入外源DNA的方法以及用于该方法的莴苣叶绿体DNA片段。几十年来，外源基因向植物核基因组的转化一直是植物基因工程的主要研究方向。然而，随着研究的深入其弊端也日益显现，如细胞核基因组大，背景复杂；导入外源基因位置随机，易引起其它性状变异；外源基因表达效率低，在后代中表达不稳定；对于来自原核生物的基因必须加以修饰和改造等，这些问题严重影响着外源基因转化技术的改进及其在实践中的应用。而外源基因向叶绿体基因组中转化在一定程度上克服了向核基因组中转化的不足，并具有独特的优越性如叶绿体转基因的拷贝数多，可实现高效表达；原核生物来源的基因，无需改造和修饰就可用于在叶绿体内高效表达；转化体后代的遗传显示母系遗传；不像核转化体，其转化的外源基因可以随花粉扩散，而叶绿体转基因植物具有良好的安全性，同时，外源基因可以在叶绿体基因组定点整合，所以叶绿体转化技术特别适合于对叶菜类植物营养价值的改良和医药工业的农业化。特别是叶绿体可超量表达外源蛋白，因此植物叶绿体有可能成为工业用酶或药用蛋白如等产品的“生物反应器”，使医药工业的产品真正成为“绿色产品”。但要进行叶绿体遗传操作必须具备两个条件一是构建植物叶绿体定点转化载体；另一个是最好建立叶片再生的组织培养转化体系。而前者是更为重要的技术环节。要构建合适的叶绿体定点转化载体，首先须选好定位片段，即与叶绿体基因组的同源片段之间发生重组的片段，从而确定外源基因的插入位点。作为定位片段，一般要求具备下面两个条件一是要有足够的DNA长度，一般为1-2kb，以保证外源DNA的有效整合(Carrer等，Mol Gen Gene，1993，24149-56；Svab等，Proc NatlAcad Sci USA，1993，90913-917；Zoubenko等，Nucl Acid Res，1994，223819-3824；McBride等，BioTechnol，1995，13362-365)；二是设计合适的插入位点。外源基因的插入既不能引起原有叶绿体基因组重要序列的丢失，又不至于干扰临近基因的正常功能。为此，人们通常选择基因的间隔区作为插入位点，因为基因的间隔区一般为非功能区。在烟草的叶绿体转化研究中常采用的插入位点在大单拷贝区的rbcL/accD(Carrer等，Mol Gen Gene，1993，24149-56；Svab等，Proc Natl AcadSci USA，1993，90913-917；Kota等，Proc Natl Acad Sci USA，1999，961840-1845)、PsbA/trnK(邹林荣等1998，张中林等2000)、和位于反向重复序列区的16S trnV/rps12(Zoubenko等，Nucl Acid Res，1994，223819-3824)。为了使外源基因整合进叶绿体基因组后能够高效表达，在构建转化载体时，一般需选用叶绿体来源的强启动子和终止子。最常用的启动子是光系统II作用蛋白基因psbA的启动子和核糖体RNA基因rrn的启动子，而常用的终止子是psbA基因的终止子，从而保证外源基因在受体植物DNA中的正常表达。此外，转化载体还需包含合适抗生素基因，以便对转化体进行有效的筛选。由于叶绿体定点转化载体中定位片段的确立是以了解叶绿体基因组序列为基础的。而目前仅有少数高等植物的叶绿体序列被全部或部分测定，因此高等植物的叶绿体转化只在这些少数植物叶开展，如烟草(McBride，1995)、拟南芥(Sikdar，1998)、水稻(Khan，1999)和马铃薯(Sidorov，1999)，这其中尤以烟草中的研究为多，工作已从转化简单的报告基因扩展到利用叶绿体转化体系获得抗虫、抗旱、抗除草剂植株、生产生物可降解塑料、乃至工业用酶或药用蛋白等方面。但由于上述植物不适于人类生食，且多含有害物质(如烟草的烟碱、马铃薯的龙葵素等)，所以不能以直接食用方式应用，限制了应用范围。作为叶菜类的代表，叶用莴苣应是作为叶绿体转化的良好受体材料，它的叶部分占全株的比例大，且可以生食，并由此而称之为生菜，另外生菜含有多种营养物质，叶片薄而脆，品质鲜嫩，味道爽口清鲜，无论生吃、炒食都受到人们的喜爱，不但是西餐做沙拉的主要蔬菜，目前也是中餐家常菜的佳品。所以利用这种植物作为叶绿体基因转化的受体来生产的药物蛋白或疫苗，完全可以直接食用方式利用，这是以往的叶绿体基因转化体系所不具备的优点。现在已报导的莴苣的核基因转化工程主要在国外，但至今还没有以莴苣叶绿体为对象进行遗传转化的报道，这与莴苣叶绿体的已知序列极少有很大关系，到目前为止有关莴苣叶绿体基因组序列的报告只有三个，登录号分别为AF162208(527bp)、AF162202(350bp)和AF162201(532bp)，这些序列不但长度不足以用于构建相应的叶绿体转化载体的同源片段，而且位点也不适宜。为建立莴苣叶绿体基因组转化体系，本专利技术利用分子生物学方法获得了足以进行构建叶绿体载体所必需的莴苣叶绿体DNA片段、并从这些片段的序列信息中分离出用于构建莴苣叶绿体定位转化载体所需的莴苣叶绿体同源重组DNA片段。本专利技术的一个目的是提供一种向莴苣叶绿体中导入外源DNA的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种用于本专利技术的方法的莴苣叶绿体DNA片段。本专利技术提供了一种向莴苣叶绿体中导入外源DNA的方法，包括利用SEQ ID NO2所示序列或者包括SEQ ID NO2所示序列3’端的不小于1kb的片段、SEQ ID NO3所示序列或者包括SEQ ID NO3所示序列5’端的不小于1kb的片段、外源DNA片段以及一种载体质粒来可以用于莴叶绿体基因组定点转化的载体质粒，其特征是外源DNA片段位于所述的两个片段之间；利用所构建的重组载体转化莴苣细胞；培养转化的细胞成为植株。本专利技术还提供了一种莴苣叶绿体的DNA片段，它含有SEQ ID NO2所示全部或部分序列的DNA片段。所述的片段的长度最好不小于1kb。本专利技术还提供了一种含有SEQ ID NO3所示全部或部分序列的DNA片段。该片段的长度最好不小于1kb。本专利技术所述的莴苣叶绿体DNA片段主要是指psbA基因及其附近的一段DNA序列，即SEQ ID NO1所示序列的片段。因为没有可供参考的莴苣叶绿体基因组序列，而且莴苣所在的菊科植物的叶绿体基因组序列也鲜有报导，所以为获得上述片段，根据烟草及拟南芥的叶绿体基因组序列设计引物来扩增莴苣叶绿体基因组的DNA，经多个引物组合的PCR扩增，发现根据烟草序列设计的两对引物可成功地扩增出莴苣叶绿体DNA片段。这两段扩增片段拼接后包含了一段连续的莴苣叶绿体基因组DNA序列，即包含trnH和psbA基因的全序列，还包含了基因trnK、rpl2和MatK的部分序列，其全长为3839bp序列。本专利技术所描述的同源重组片段是根据SEQ ID NO1所示序列重新设计引物扩增得到的。该序列中适于作外源DNA片段定点插入的位置是莴苣叶绿体基因组中trnH与psbA基因之间及trnK与psbA之间。由于psbA与trnk基因有可能存在共同转录，所以本专利技术重点推选trnH与psbA基因间作为外源DNA片段定点插入位置。根据此位点在本专利技术中提供了相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种向莴苣叶绿体中导入外源ＤＮＡ的方法，包括：利用ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示序列或者包括ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示序列３’端的不小于１ｋｂ的片段、ＳＥＱＩＤＮＯ：３所示序列或者包括ＳＥＱＩＤＮＯ：３所示序列５’端的不小于１ｋｂ的片段、外源ＤＮＡ片段以及一种载体构建重组载体，使外源ＤＮＡ片段位于所述的ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示序列或者包括ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示序列３’端的不小于１ｋｂ的片段和ＳＥＱＩＤＮＯ：３所示序列或者包括ＳＥＱＩＤＮＯ：３所示序列５’端的不小于１ｋｂ的片段之间；利用所构建的重组载体转化莴苣细胞；培养转化的细胞成为植株。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡赞民，石锐，杨晨敏，陈正华，
申请(专利权)人：中国科学院遗传研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]