人造的芸苔属衍生的叶绿体转运肽制造技术

本发明专利技术涉及用于将肽、多肽和蛋白质导向到含质体细胞的质体上的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明专利技术涉及可以将多肽导向到质体上的叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide)，及编码它的核酸分子。在一些实施方案中，本发明专利技术涉及用于产生含有叶绿体转运肽的转基因植物材料(例如转基因植物)的方法，以及通过这种方法产生的植物材料，和从其产生的植物商业产品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人造的芸苔属衍生的叶绿体转运肽 优先权声明 本申请要求获得2012年4月17日提交的美国临时专利申请系列号 No. 61/625, 222 的利益。 根据37C. F. R. § 1. 821 (c)或（e)_作为ASCII文本文件提交的序列表的声明根据37C. F. R. § 1. 821 (C)或（e)，含有ASCII文本格式的序列表的文件已经和本 专利申请一起提交。
本公开涉及用于遗传编码和表达被导向到含质体细胞的质体上的多肽的组合物 和方法。在某些实施方案中，本公开涉及将多肽导向到（例如高等植物的）叶绿体上的氨 基酸序列，和/或编码所述氨基酸序列的核酸分子。在某些实施方案中，本公开涉及嵌合多 肽，其含有控制该嵌合多肽到质体的转运的氨基酸序列，和/或编码该嵌合多肽的核酸分 子。 背景 植物细胞含有多种不同的亚细胞细胞器，它们被统称为质体，由特征性的膜系 统限定边界并在细胞内执行专化的功能。某些质体负责光合作用，以及特定化合物的合成 和储存。所有质体均来源于存在于植物的分生组织区内的原质体（proplastids)。原质体 可能发育成，例如：叶绿体，黄化体（etioplasts)，有色体，老质体（gerontoplasts)，白色 体（leucoplasts)，淀粉体，油质体（elaioplasts)和蛋白质体（proteinoplasts)。质体以 一种半自主的方式存在于细胞内，它们含有其自身的遗传体系和蛋白质合成机构，但其发 育和生物合成活性依赖与细胞核-细胞质系统的密切合作。 在_等植物的光合作用叶细胞中，最让人关注的质体是叶绿体。叶绿体最基本的 功能是实施光驱动的光合作用反应。但是，叶绿体还实施许多其它对于植物细胞重要的生 物合成过程。例如，细胞的所有脂肪酸均是由位于叶绿体基质内的酶使用在叶绿体基质内 容易获得的ATP、NADPH和碳水化合物制造的。而且，在叶绿体中，光活化电子的还原力驱动 亚硝酸盐（NCV)还原成氨（NH 3);这种氨为植物提供了合成氨基酸和核苷酸所需的氮。 叶绿体还参与农用化学品工业中的特别重要的过程。例如，已知许多除草剂通过 阻断在叶绿体内运作的功能来发挥作用。新近的研究已经鉴定了多种除草剂的特定靶标。 例如，三嗪衍生的除草剂通过将质体醌分子从其在光系统II的32kD多肽中的结合位点上 取代下来而抑制光合作用。这个32kD多肽由叶绿体基因组编码，并由细胞器机构合成。已 经获得了对三嗪类除草剂有抗性的突变体植物。这些植物含有突变的32kD多肽，其上面的 质体醌不再能够被三嗪类除草剂取代。磺酰脲类抑制叶绿体中的乙酰乳酸合酶。乙酰乳 酸合酶参与异亮氨酸和缬氨酸的合成。草甘膦抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶 (EPSPS)，其是一种参与芳香族氨基酸人造的酶。所有这些酶都是由细胞核基因组编码的， 但它们被转运到叶绿体内，实际的氨基酸合成在叶绿体内进行。 大多数叶绿体蛋白质在植物细胞的细胞核内编码，在胞浆中合成为更大的前体蛋 白，并在翻译后被转运到叶绿体中。跨越外层和内层包膜而转运进入基质是以基质、类囊体 膜和类囊体腔为目的地的蛋白质的主要进入机制。被转入的前体蛋白向类囊体膜和类囊体 腔的定位通过四种不同的机制完成，其中两种与细菌蛋白质转运系统同源。因此，将蛋白定 位在叶绿体内的机制在一定程度上是来源于原核共生菌。Cline and Henry (1996)，Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:1-26。 运往叶绿体表达的前体蛋白含有称作叶绿体转运肽（CTP)的N端延伸 (extension)。转运肽在叶绿体表面的特异性识别中起作用，并参与介导在翻译后将前体 蛋白转运通过叶绿体包膜，并从叶绿体包膜转运到叶绿体的各个亚室（sub-compartment) (如基质、类囊体和类囊体膜）。这些N端转运肽序列包含将叶绿体蛋白转运到质体内所需 的全部信息；转运肽序列对于质体引入是必要而充分的。 据报道在其N端具有天然编码的转运肽序列的植物基因包括：核酮糖1，5二磷 酸羧化酶（RuBisCo)的叶绿体小亚基（de Castro Silva-Filho et al. (1996)，Plant Mol. Biol. 30:769-80 ;Schnell et al. (1991)，J. Biol. Chem. 266:3335-42) ;EPSPS(见， 例如，Archer et al. (1990)，J.Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810 和美国专利 6,867,293,7,045,684，和 Re.36,449);色氨酸合酶（21^〇6七&1.(1995)，了.81〇1. Chem. 270:6081-7);质体蓝素（Lawrence et al. (1997)，J. Biol. Chem. 272:20357-63);分 支酸合酶（Schmidt et al. (1993)，J. Biol. Chem. 268:27447-57);捕光叶绿素 a/b 结合蛋 白（LHBP)(Lamppa et al. (1988)，J. Biol. Chem. 263:14996-14999)，和拟南芥的叶绿体蛋 白（Lee et al. (2008)，Plant Cell20:1603-22)。美国专利公开 No. US 2010/0071090 提供 了 一些来自衣藻的叶绿体导向性肽。 然而，由于叶绿体导向肽的序列有高度多样性且缺少共同或共有序列基序，虽然 有可能存在具有独立结构基序的叶绿体导向肽的独特亚群，但是叶绿体导向肽所编码信息 的结构要求仍然难以把握。Lee等人.（2008)，同上。此外，并非所有这些序列均可用于在 高等植物中异源表达叶绿体导向的蛋白质。 公开 本文描述了用于植物中多肽的质体导向的组合物和方法。在一些实施方案中，组 合物包含核酸分子，核酸分子包含至少一个编码与感兴趣的核苷酸序列可操作地连接的人 造芸苔属来源叶绿体转运肽（例如TraP8肽和TraP9肽）。在特定的实施方案中，这些核酸 分子可用于单子叶或双子叶植物中由感兴趣的核苷酸序列编码的多肽的表达和导向。进一 步描述了包含核酸分子的载体，所述核酸分子含有至少一个编码与感兴趣的核苷酸序列可 操作地连接的人造芸苔属来源叶绿体转运肽的核苷酸序列。 在一些实施方案中，编码人造芸苔属来源CTP的核苷酸序列可以是这样的核苷 酸序列，该序列衍生自从芸苔属物种基因（欧洲油菜（B.napus)、芜青（B.rapa)、芥菜 (B.Juncea)和埃塞俄比亚芥（B.carinata))获得的参考核苷酸序列，或其功能性变体。在 一些实施方案中，编码人造芸苔属来源CTP的核苷酸序列可以是嵌合核苷酸序列，其包含 来自芸苔属物种基因的部分CTP编码核苷酸序列，或其功能性变体。在特定的实施方案中， 编码人造芸苔属来源CTP的核苷酸序列可含有多个连续的核苷酸序列，这些核苷酸序列分 别获自：参考芸苔属物种CTP，和来自该芸苔属物种的不同基因、不同芸苔属物种、或不同 生物体（例如植物、原核生物和低等光合真核生物）本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，包含：人造的芸苔属(Brassica)来源的核苷酸序列，其编码包含第一芸苔属叶绿体转运肽的连续氨基酸序列的肽，该肽还包含第二叶绿体转运肽的连续氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.17 US 61/625,2221. 一种分尚的核酸分子，包含： 人造的芸苔属（Brassica)来源的核苷酸序列，其编码包含第一芸苔属叶绿体转运肽 的连续氨基酸序列的肽，该肽还包含第二叶绿体转运肽的连续氨基酸序列。2. 权利要求1的分离的核酸分子，其还包含感兴趣的核苷酸序列，所述感兴趣的核苷 酸序列与该人造的芸苔属来源的核苷酸序列可操作地连接。3. 权利要求1的分离的核酸分子，其中所述第一芸苔属叶绿体转运肽来自欧洲油菜 (Brassica napus)或完善（Brassica rapa) 〇4. 权利要求3的分离的核酸分子，其中所述第二叶绿体转运肽来自与第一芸苔属叶绿 体转运肽不同的芸苔属物种。5. 权利要求1的分离的核酸分子，其中所述第一芸苔属叶绿体转运肽来自3-烯醇式丙 酮酰莽草酸-5-磷酸合成酶基因。6. 权利要求1的分离的核酸分子，其中所述第二叶绿体转运肽来自3-烯醇式丙酮酰莽 草酸-5-磷酸合成酶基因。7. 权利要求1的分离的核酸分子，其中所述肽与选自SEQ ID N0:3和4的叶绿体转-肽 至少80%相同。8. 权利要求7的分离的核酸分子，其中所述肽与选自SEQ ID NO:3和4的叶绿体转运 肽至少85 %相同。9. 权利要求8的分离的核酸分子，其中该肽与选自SEQ ID NO:3和4的叶绿体转运肽 至少90%相同。10. 权利要求9的分离的核酸分子，其中该肽与选自SEQ ID NO: 3和4的叶绿体转运肽 至少95%相同。11. 权利要求10的分离的核酸分子，其中该肽与选自SEQ ID N0:3和4的叶绿体转运 肽至少98 %相同。12. 权利要求11的分离的核酸分子，其中该肽选自SEQ ID N0:3和4。13. 权利要求1的分离的核酸分子，其中该感兴趣的核苷酸编码序列不编码SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO:2 的肽。14. 权利要求1的分离的核酸分子，其中编码该肽的核苷酸序列能够与选自SEQ ID NO:5, 6, 8和9的核苷酸序列特异性杂交。15. 权利要求2的分离的核酸分子，还包含至少一个额外的核苷酸序列，所述额外的核 苷酸序列分别编码叶绿体转运肽，其中所述额外的核苷酸序列与所述感兴趣的核苷酸序列 可操作地连接。16. 权利要求15的分离的核酸分子，其中所述至少一个额外的核苷酸序列来自选自下 组的生物：原核生物、低等光合真核生物、和绿藻。17. 权利要求2的分离的核酸分子，其中所述人造的芸苔属来源的核苷酸序列以及感 兴趣的核苷酸序列与一个或多个调节序列可操作地连接。18. 权利要求2的分离的核酸分子，其中该核酸分子编码嵌合多肽，嵌合多肽包含由所 述感兴趣的核苷酸序列编码的肽和由所述人造的芸苔属来源的核苷酸序列编码的肽。19. 由权利要求18的核酸分子编码的嵌合多肽。20. 权利要求19的嵌合多肽，其中由所述感兴趣的核苷酸序列编码的肽被导向到含质 体细胞中的质体。21. 权利要求20的嵌合多肽，其中该多肽包含叶绿体转运肽，当由所述感兴趣的多核 苷酸序列编码的肽被导向到质体时，该叶绿体转运肽被除去。22. 权利要求19的嵌合多肽，其中该由感兴趣的核苷酸序列编码的肽是生物活性肽。23. 权利要求19的嵌合多肽，其中该由感兴趣的核苷酸序列编码的肽是荧光肽。24. 权利要求22的嵌合多肽，其中该生物活性肽是酶。25. 权利要求22的嵌合多肽，其中该生物活性肽正常表达于天然表达所述肽的细胞的 质体中。26. 权利要求22的嵌合多肽，其中该生物活性肽参与选自下组的过程：除草剂抗性， 病毒抗性，细菌病原体抗性，昆虫抗性，线虫抗性，真菌抗性，植物活力，植物产量，温度耐受 性，土壤条件耐受性，低光照水平耐受性，低水位耐受性，高水位耐受性，化学环境耐受性， 种子颜色，淀粉改性，氨基酸合成，光合作用，脂肪酸合成，油合成，类胡萝卜素合成，萜类合 成，淀粉合成，和除草剂抗性。27. 权利要求22的嵌合多肽，其中该生物活性肽选自下组：玉米黄质环氧酶，胆碱单加 氧酶，亚铁螯合酶，《 -3脂肪酸去饱和酶，谷氨酰胺合成酶，维生素原A，激素，Bt毒素蛋白， 和对于鉴定含有感兴趣的性状的植物有用的标志物。28. 权利要求26的嵌合多肽，其中所述生物活性肽参与除草剂抗性。29. 权利要求24的嵌合多肽，其中所述生物活性肽选自下组：乙酰乳酸合酶（ALS)， 突变的ALS，ALS的前体，3-烯醇式丙酮酰莽草酸-5-磷酸合酶（EPSPS)，CP4EPSPS，III类 EPSPS，和 IV 类 EPSPS。30. 包含权利要求2的核酸分子的植物表达载体。31. 包含权利要求2的核酸分子的植物材料。32. 权利要求31的植物材料，其中该植物材料选自下组：植物细胞、植物组织、植物组 织培养物、愈伤组织培养物、植物部分、和全植物。33. 权利要求31的植物材料，其还包含含有所述肽的多肽。34. 权利要求33的植物材料，其中所述感兴趣的核苷酸序列编码所述多肽的被导向到 该植物材料的细胞中的质体的部分。35. 权利要求31的植物材料，其中所述核酸分子稳定整合到来自所述植物材料的细胞 的基因组中。36. 权利要求31的植物材料，其中所述植物材料是全植物。37. 权利要求31的植物材料，其中所述植物材料是不能再生而产生植物的植物细胞。38. 权利要求31的植物材料，其中所述植物材料来自选自下组的植物：拟南芥属，苜 蓿，芸苔属，豆类，西兰花，卷心菜，胡萝卜，花菜，芹菜，大白菜，棉花，黄瓜，茄子，莴苣，甜 瓜，豌豆，胡椒，花生，...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·里拉，R·M·西奇洛，C·耶基斯，A·E·罗宾逊，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国;US