一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用。该海洋微藻叶绿体表达载体包含同源重组序列Ｉ、目的基因表达盒和同源重组序列ＩＩ；目的基因表达盒位于同源重组序列Ｉ和同源重组序列ＩＩ之间；同源重组序列Ｉ的第１～９７２ｂｐ是ｒｎｓ的３’部分，第９７３～１０９７ｂｐ是ｔｒｎＩ的５’部分；同源序列ＩＩ的第１～１９６ｂｐ是ｔｒｎＡ基因的３’部分，第１９７～１４８３ｂｐ是ｒｎｌ的５’部分。该同源重组序列使得通过电击法即可将表达载体导入海洋微藻叶绿体基因组中，方便了载体导入叶绿体基因组的途径并大大降低了转化成本，为实现利用海洋微藻叶绿体为生物反应器生产高附加值产品提供了技术支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微藻基因工程领域，具体涉及一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用。
技术介绍
自从1984年首例转基因植物烟草问世以来，向植物细胞核中转化外源基因一直 是植物基因工程的主要研究方向。但是由于外源基因在植物细胞核中表达量低下、在后代 中表达不稳定、以及核基因容易随花粉扩散所带来的生态安全性等问题的存在。与传统的 核转基因相比，叶绿体转化有着诸多优点每个植物细胞中都存在大量的叶绿体拷贝，使得 外源基因得到核基因转化很难实现的超量表达；外源基因通过同源重组定点整合在叶绿体 基因组后不会产生位置效应和基因沉默现象；叶绿体遗传转化具有母性遗传的特点，有望 解决核基因转化系统中因花粉扩散带来的生物安全性问题；大多数叶绿体基因以操纵子的 形式存在，可实现多个外源基因在叶绿体基因组中同时转化和表达；在叶绿体中表达的蛋 白质可以形成二硫键，人源蛋白表达后也可以被正确折叠。海洋微藻是海洋生态系统的初级生产者，约占海洋生物物种的40. 86%，微藻还具 有生长周期短，繁殖速度快，可塑性强，对营养要素要求简单，叶绿体占微藻细胞大部分体 积等特点。硅藻是大量存在于海洋生态系统中单细胞浮游植物，因为其占地球初级生产力 总量的25%并且和02的生成密切相关从而被认为具体重要的作用。目前已经成功进行叶绿体转化的真核藻类仅有莱茵衣藻，该转化体系中利用叶绿 体来源的启动子终止子来调控外源基因的表达，通过基因枪技术将载体导入叶绿体基因组 中，获得了成功表达，但海洋微藻的叶绿体转化体系还未被建立，而且传统的叶绿体转化载 体导入受体叶绿体基因组中都是通过基因枪技术来完成，操作复杂且成本较高。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的不足之处和缺陷，提供一种海洋微藻叶绿 体表达载体。本专利技术的另一目的在于提供所述海洋微藻叶绿体表达载体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种海洋微藻叶绿体表达载体，包含同源 重组序列I、目的基因表达盒和同源重组序列II ；目的基因表达盒位于同源重组序列I和同 源重组序列II之间；所述同源重组序列I如下所示，由rns (核糖体RNA小亚基基因，编码16s核糖体 RNA小亚基)的3’部分和trnl的5’部分组成的，同源重组序列I中的第1 972bp是rns 基因的3，部分，第973 1097bp是trnl的5，部分；1 ACTGGGCGTA MGCGTCTGT AGGTGGTCCA ATAAGTCAAC TGTTMATCT TGAGGCTCM61 CCTCGAMTC GCAGTCGAAA CTATTAGACT AGAGTATAGT AGGGGTAAAG GGAATTTCCA121 GTGGAGCGGT GAAATGCGTA GAGATTGGAA AGAACACCGA TGGCGAAGGC ACTTTACTGGACGAAAGCTAGGGTAGCAAATGGGATTAGATACCCCAGTA1CGGGGGTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCTCTGGTTCM61ATCCAGMTGGCCCAACGGGGGTATAGCTCAGTTGGTAGAGCACCGCCTTTGCACGGCGG121TTGTCAGCGGTTCGAATCCGCTTACCTCCACATGMAAATTTTAACATTTTTTMTCATA181AGATTAMTAAGTCTTMATTCAAGGAATTAAGAGTTTATGGGGGATACCTTGGCATTCA241GMGCGATGAAGGACGTGGTTACCGACGAAACGCTTCGGGGAGCTGGAAACAAGCTATGA301TCCGGAGATCTCCGAATGAGGAAACTCTAATACTACTTATTGAATACATAAATMGAAAG361AGCGAACCTAGGGAACTGAAACATCTTAGTACCTAGAGGAAAAGMAGTAAAAACGATTC421CCTTAGTAGCGGCGAGCGAAATGGGMCAGCCTAMCTTAATTTTAAGGGTAGCGGGACA481ATTATTMTGATTAAATGTGACAATTAGACGAACTTAGATGGAATGCTAAACCAAAGAGA541GTGATAGTCTCGTAGTCGAAMTTGMACAATCAMTTGTATCCCAAGTAGCATGGAGCA601CGTGAAATTCCGTGTGMTCAGCGAGGACCACCTCGTAAGGCTAMTATTCCTGAATGAC661CGATAGTGAAATAGTACCGTGAGGGMAGGTGAAMGAACCCCGGGAGGGGAGTGAAAAG721AACATGMACCATAAACTTACAACCAGTAGGAGGACGACTAAAACGTCTGACTGCGTGCC781TGTTGAAGAATGAGCCGGCGACTTATAAGTAGTGGCAGGTTAAGGTAGAGAATACCGGAG841CCATAGTGAAAGCGAGCCTGMTAGGGCGTTTGTCACTGGTTATAGACCCGAACCCGGAT901GATCTAACCATGGCCAGGTTGAAGCTTAGGTAATACTAAGTGGAGGACCGAACCGACTGA961TGTTGAMAATCAGCGGATGAGTTGTGGTTAGGGGTGAAATGCCMTCGAATTCGGAGCT1021AGCTGGTTCTCCCCGAMTGCGTTTAGGCGCAGCGATGAATGTTATAGCTTAGGGGTAM1081GCACTGTTACGTATGCGGGCTGGTAATTCGGTACCAAATCGTTGCAAACTAAGMTACTA1141AGTGTACAGTTCATCAGTGAGACTGTGGGGGATAAGCTCCATTGTCAAGA GGGMACAGC41201 CCAGAGCACC AGTTAAGGCC CCTAAATAAT TGCTMGTGA TAAAGGAGGT GGGAGTGCAT1261 AGACAATCAG GAGGTTTGCT TAGAAGCAGC AATCCTTTAA AGAGTGCGTA ATAGCTCACT1321 GATCGAGTAA ACCTGCGCCG MAATGTACG GGACTAAGTA ATTTGCCGAA ACTGTGCGAT1381 ATATAAMTA TATCGGTAGG GGAGCGTTCT GTTGTAGGTT GAAGTATTAG CGGMGCGGA1441 TATGGACGAA GCAGAAGTGA GAATGTCGGC TTGAGTAACG AAA所述海洋微藻叶绿体表达载体还包含抗性筛选表达盒或荧光蛋白表达盒；所述的表达盒是指含有启动子、基因和终止子、且其中的基因能正常进行转录和 翻译的序列；所述的目的基因表达盒由启动子、目的基因和终止子组成；所述目的基因表达盒的启动子优选为CaMV 35S启动子；所述目的基因表达盒的终止子优选为NOS终止子；所述的抗性筛选表达盒由启动子、抗性筛选标记基因和终止子组成；所述抗性筛选表达盒的抗性筛选标记基因优选为氯霉素抗性基因；所述的荧光蛋白表达盒由启动本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋微藻叶绿体表达载体，其特征在于该海洋微藻叶绿体表达载体包含同源重组序列Ⅰ、目的基因表达盒和同源重组序列Ⅱ；目的基因表达盒位于同源重组序列Ⅰ和同源重组序列Ⅱ之间；　　所述同源重组序列Ⅰ如ＳＥＱ　ⅠＤ　Ｎｏ．１所示，其中第１～９７２ｂｐ是编码１６ｓ核糖体ＲＮＡ小亚基基因的３’部分，第９７３～１０９７ｂｐ是ｔｒｎⅠ的５’部分；　　所述同源重组序列Ⅱ如ＳＥＱ　ⅠＤ　Ｎｏ．２所示，其中第１～１９６ｂｐ是ｔｒｎＡ基因的３’部分，第１９７～１４８３ｂｐ是编码２３ｓ核糖体ＲＮＡ大亚基基因的５’部分。

【技术特征摘要】
一种海洋微藻叶绿体表达载体，其特征在于该海洋微藻叶绿体表达载体包含同源重组序列I、目的基因表达盒和同源重组序列II；目的基因表达盒位于同源重组序列I和同源重组序列II之间；所述同源重组序列I如SEQ ID No.1所示，其中第1～972bp是编码16s核糖体RNA小亚基基因的3’部分，第973～1097bp是trnI的5’部分；所述同源重组序列II如SEQ ID No.2所示，其中第1～196bp是trnA基因的3’部分，第197～1483bp是编码23s核糖体RNA大亚基基因的5’部分。2.根据权利要求1所述所述海洋微藻叶绿体表达载体，其特征在于该海洋微藻叶绿 体表达载体还包含抗性筛选表达盒或荧光蛋白表达盒。3.根据权利要求1或2所述海洋微藻叶绿体表达载体，其特征在于所述的目的基因 表达盒由启动子、目的基因和终止子组成。4.根据权利要求3所述海洋微藻叶绿体表达载体，其特征在于所述目的基因表达盒 的启动子为CaMV 35S启动子；所述目的基因表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏业，朱聪聪，杨维东，刘洁生，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]