本发明专利技术公开了一个叶绿体发育必需的蛋白质及其基因和应用。该基因编码蛋白质是具有SEQINNO:2所示的氨基酸序列，该编码基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。该水稻叶绿体发育必需基因发生突变可导致叶绿体发育受阻，幼苗即表现为完全白化，且在三叶期后逐渐干枯死亡。将其应用于植物遗传改良工作，是重要的指示基因。应用于杂交水稻制种，可方便检测杂交后代的纯度。应用于常规水稻制种，由于其纯合致死特点，可有效防止留种以保护品种拥有者的知识产权。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程领域，具体的说，本专利技术涉及一种利用图位克隆技术克 隆水稻ALl基因（其编码蛋白质为水稻叶绿体核糖体大亚基蛋白L12,简称PRPL12)以及利 用转基因实验鉴定该基因的功能，同时利用该基因调节叶绿体发育，应用于杂交水稻制种 中。
技术介绍
高等植物的叶绿体发育是和其叶片发育紧密相关的。叶绿体的形成需要质体和核 基因组协调控制，且绝大部分是受到核基因调控，约95%的质体蛋白质是核基因编码的。叶 绿体发育过程中的任何突变通常都会导致叶色突变。研宄水稻苗期白化致死突变可以帮助 深入了解叶绿体发育的机制，同时白化致死基因可以应用于水稻制种工作中，提高制种质 量，保护种子生产者的合法权益。 叶绿体发育及叶片生长可以分为三个步骤：第一步是质体的复制和质体DNA合成 的激活；第二步是叶绿体建成阶段；第三步是光合器官高丰度的合成。在叶绿体建成阶段 叶绿体转录和翻译器官的形成需要大量质体核糖体蛋白。非必需质体核糖体蛋白突变会导 致叶绿素合成缺失，而必需质体核糖体蛋白的突变会导致宿主细胞的死亡。 植物中已经发现存在三类核糖体，即在细胞质中、线粒体中和叶绿体中，其中叶绿 体核糖体蛋白组成已经全部被鉴定出来，但是其具体功能还不清楚。拟南芥叶绿体核糖 体L21在编码区的一个单碱基变异导致类囊体膜和叶绿体不能正常形成（Yin等，Planta， 2012, 235:907-921)。水稻质体核糖体蛋白的S20、L13和L21的突变体也都表现出相似的白 化表型，但还不知道它们具体的产生机制（Gong等，G3, 2013, 3:1769-1777 ;Song等，Plant Mol Biol，2014,84:301-314;Lin 等，Plant Biology，2014,17:599-607)。但总的来说，植 物质体核糖体蛋白的克隆及生物学功能的研宄还远远不够深入。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种从水稻幼苗完全白化突变体中克隆的新基因 ALl，该基因编码一个叶绿体核糖体大亚基蛋白（PRPL12)，是叶绿体发育必需蛋白质。 本专利技术提供了一种叶绿体发育所必需的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID No. 2(即序 列表中的序列2)所示的氨基酸序列，且由基因 ALl编码。 作为本专利技术的蛋白质的改进：氨基酸序列还包括在SEQ ID No. 2所述的氨基酸序 列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。 本专利技术同时还提供编码上述蛋白质的基因，例如其具有SEQ ID No. 1 (即序列表中 的序列1)所示的核苷酸序列。 作为本专利技术的基因的改进：核苷酸序列还包括在SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列 中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因和衍生物。本专利技术 还提供了含有上述的叶绿体发育所必需的蛋白质编码基因的转基因细胞系。 含有上述的叶绿体发育所必需的蛋白质编码基因的转基因重组菌。 本专利技术同时还提供了上述基因的用途：用于构建转基因水稻。具体是在培育导致 叶绿体发育受阻，苗期白化致死的转基因植物中的应用。 本专利技术同时还提供了一种转基因细胞，为包含本专利技术所述基因的转基因植物细 胞。 本专利技术的具体实施步骤如下： -、水稻幼苗完全白化突变体all的分离和表型分析 本研宄水稻突变体all，其在田间表型的主要特征是：从种子萌发至三叶期幼苗 表现为完全白化，三叶期后随着种子养分耗尽，白化幼苗逐渐干枯死亡（图1)。叶绿素测 定结果显示突变体all的幼苗的叶绿素含量显著低于野生型（图2)。利用透射电镜（TEM) 观察野生型和all的幼苗二叶期叶片叶绿体超微结构，发现野生型的叶绿体含有正常的片 层结构，而all叶肉细胞中仅含有类似于空泡的囊状结构（图3)。 二、水稻ALl基因的遗传分析及图位克隆 1.突变体性状的遗传分析 在以日本晴为轮回亲本，9311(又名扬稻6号，江苏省里下河地区农科所育成品 种，品种审定编号：国审稻2001002)为供体亲本的染色体片段替换系中发现一个株系，其 后代始终表现为白化苗和绿苗分离。突变体杂合株系均表现为正常绿色，随机选取5个杂 合株系，其自交F2群体中正常植株与突变体植株分离比接近3:1 (表1)，表明此突变体性状 由一对隐性核基因控制。 表1随机的5个F2分离群体分离比例 Ρ<(λ Ub 农不显者。 2. ALl基因的图位克隆 为了分离ALl基因，本专利技术首先建立了一个大的突变体杂合株系作为Fl代，从自 交产生的F2代表型分离群体中选取其中的隐性个体进行基因定位，利用已有的均匀覆盖 全基因组的分子标记对ALl位点进行初步定位，将其初步定位在地1染色体的长臂上，介于 标记ΙΝ105和Chr 102之间。然后通过对两标记之间的序列进行分析，发展了多个新的分子 标记，最终将ALl精细定位与标记CAPS107和CAPS113之间约42. 2kb的范围之内（图4)。 根据精细定位结果，分析发现在此区段内存在7个开放阅读框（ORF2, SEQ ID No. 1)，其中 0RF2编码一个叶绿体核糖体大亚基L12蛋白（PRPL12)。序列分析表明，突变体all中0RF2 存在一个特殊的单核苷酸多态性位点（single nucleotide polymorphism，SNP)，白化苗中 该SNP位点不同于日本晴和9311，因此0RF2(PRPL12)可能就是ALl的目的基因。 3. ALl基因功能互补研宄 为了证明0RF2(PRPPL12)就是ALl的目的基因，我们对突变体all进行了转基因 互补试验验证。转基因互补验证主要是将野生型ALl基因全长基因组序列克隆到双元植 物转基因载体PCAMBIA1300的多克隆位点。将构建好的重组载体pl300-ALl通过农杆菌 介导的遗传转化体系转化突变体杂合株系愈伤，经过抗性愈伤筛选得到转基因苗。转化了 ALl基因的突变体杂合株系愈伤得到转基因阳性株系，转基因阳性株系幼苗恢复正常绿色 表型，形态和正常野生型幼苗没有差异（图5)。转基因互补试验确证了突变体表型是由 ALl基因（0RF2, PRPL12)突变引起的，表明本专利技术获得了使突变体恢复正常功能的转基因 水稻。 本专利技术利用水稻幼苗完全白化突变体，通过图位克隆法得到ALl基因，该基因编 码叶绿体核糖体大亚基L12蛋白（Plastid ribosome protein L12，PRPL12)。通过转基因 互补实验证明了 ALl基因在水稻叶绿体发育形成方面扮演了必不可缺的角色。因而本专利技术 为完善叶绿体发育机制研宄打下了基础。【附图说明】 图1是野生型日本晴和all突变体幼苗不同发育时期的表型。A为萌发初期，B为 二叶期，C为三叶期后幼苗接近干枯死亡时期。A，B，C左边为野生型，右边为all突变体。 图2是野生型与突变体all的叶绿素含量分析。A为叶绿素 a(Chla)，叶绿素 b (Chlb)及类胡萝卜素（Car)含量比较，B为叶绿素 a与叶绿素 b含量比率（Chi a/b)。 图3为野生型与突变体all的叶绿体超微结构比较分析。A-C为野生型二叶期叶 片叶肉细胞叶绿体观察，D-E为突变体二叶期叶片叶肉细胞叶绿体观察。 图4为ALl基因的图位克隆。A为精细定位；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种叶绿体发育所必需的蛋白质，其特征在于该蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘巧泉，赵冬生，张昌泉，李钱峰，顾铭洪，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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