大豆灰斑病菌的特异性分子检测引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种大豆灰斑病菌的特异性分子检测引物及其应用，一种大豆灰斑病菌特异性分子检测引物，包括上游引物和下游引物，如序列表SEQ ID No.1‑2所示。该引物对能够在大豆灰斑病菌中特异性地扩增得到769bp的目标产物。所述的检测引物在检测大豆灰斑病中和制备检测大豆灰斑病检测试剂盒中的应用。该引物特异性强，能用于区别大豆菌核病、大豆紫斑病、大豆疫霉根腐病、大豆赤霉病、大豆立枯病等大豆常见病害的病原菌；灵敏度高，对大豆灰斑病菌基因组DNA的检测灵敏度可达1ng/μL；使用方法简单快捷，无需对PCR产物进行克隆、测序、酶切等操作。

Specific molecular detection primers for soybean Grey Spot Pathogen and its application

Detection of specific molecular primers of the present invention relates to a soybean frogeye leaf spot and its application, a detection of c.sojinum specific molecular primers, including upstream primer and downstream primer sequence, such as a list of SEQ ID No.1 2 shows. The primer can specifically amplify the target product of 769bp in soybean grey spot pathogen. The detected primers were used in the detection of soybean Grey Spot Disease and the detection kit for detection of soybean ash spot. The primer specificity, can be used for pathogen Sclerotinia stem rot of soybean and soybean from purple blotch, Phytophthora root rot of soybean, soybean, soybean and soybean blight scab disease; high sensitivity of c.sojinum genomic DNA detection sensitivity to 1ng/ L; the method is simple and quick, without cloning, sequencing and enzyme digestion of PCR products and other operations.

【技术实现步骤摘要】
大豆灰斑病菌的特异性分子检测引物及其应用
本专利技术涉及一种大豆灰斑病菌的特异性分子检测引物及其应用。
技术介绍
大豆作为人类食物和牲畜饲料中蛋白质的主要来源，也是重要的油料作物，在世界范围内广泛种植。在我国，大豆已经成为继水稻、小麦、玉米、棉花之后的第五大作物，在我国农业生产中占有重要地位。大豆灰斑病是一种由大豆尾孢菌(CercosporasojinaHara)侵染引起的真菌病害，在大豆生产上危害严重，在病害流行年份一般可造成10％-30％的减产，严重时可减产50％，还能严重影响大豆品质。病菌以菌丝体及分生孢子在病残体及种子上越冬，成为翌年的初侵染源，初侵染后在受害植株病部产生分生孢子，借助风雨进行传播，从而使得病害在田间迅速蔓延。因此，在发病初期对大豆灰斑病菌进行快速、准确的检测和鉴定，对于有效控制大豆灰斑病的发生和传播具有重要的意义。大豆灰斑病菌传统的检测鉴定方法需要对病原物进行分离纯化，观测其培养特征和形态结构，该过程耗时长且准确度较低，受人为及环境因素的干扰较大。随着分子生物学技术的发展，PCR(Polymerasechainreaction)技术被广泛应用到了病原菌的检测鉴定工作中。病原真菌的分子鉴定多以ITS基因为基础，综合PCR扩增、基因测序、RAPD分析、系统发育分析等方法，所需时间仍然相对较长，如2010年张俊华等使用真菌ITS基因通用引物ITS1/ITS4，通过对大豆灰斑病菌ITS基因的扩增并结合3种限制性内切酶的酶切才实现了对大豆灰斑病菌16个生理小种的区分。而且，包括大豆灰斑病菌在内的部分真菌的ITS序列种间相似性很高，无法设计特异性检测引物。
技术实现思路
针对现有技术对大豆灰斑病菌的检测鉴定周期长，且没有特异性分子检测引物的实际问题，本专利技术提供一种基于真菌β-tublin基因序列的大豆灰斑病菌特异性分子检测引物及其应用，可实现对大豆灰斑病菌的一步法PCR检测。本专利技术所采用的技术如下：一种大豆灰斑病菌特异性分子检测引物，包括上游引物和下游引物，上游引物TF1，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示，下游引物TR1，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。本专利技术还具有如下技术特征：1、利用如上所述的检测引物能够在大豆灰斑病菌中特异性地扩增得到769bp的目标产物。2、采用如上所述的检测引物PCR检测大豆灰斑病的方法，以待检测样本DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：2.5μL10×PCR缓冲液，浓度25mM1.5μLMg2+，浓度10mM0.5μLdNTP，2.5UTaqDNA聚合酶，上游引物TF110μM和下游引物TR110μM各1.0μL，DNA模板1.5μL，ddH2O16.5μL；PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；取5.0μLPCR产物在1.5％m/v琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在紫外光下观测扩增产物大小，若能特异性地扩增出769bp的产物即判定所测样品为大豆灰斑病样品。3、如上所述的检测引物在检测大豆灰斑病中的应用。4、如上所述的检测引物在制备检测大豆灰斑病检测试剂盒中的应用。5、一种大豆灰斑病检测试剂盒，包括如上所述的检测引物。6、如上所述的试剂盒，还包括2.5μL10×PCR缓冲液，浓度25mM1.5μLMg2+，浓度10mM0.5μLdNTP，2.5UTaqDNA聚合酶，上游引物TF110μM和下游引物TR110μM各1.0μL，DNA模板1.5μL，ddH2O16.5μL。本专利技术有以下有益效果：该引物特异性强，能用于区别大豆菌核病、大豆紫斑病、大豆疫霉根腐病、大豆赤霉病、大豆立枯病等大豆常见病害的病原菌；灵敏度高，对大豆灰斑病菌基因组DNA的检测灵敏度可达1ng/μL；使用方法简单快捷，无需对PCR产物进行克隆、测序、酶切等操作，全部操作过程可以在数小时内完成。附图说明图1为本专利技术所涉及的引物TF1/TR1对大豆灰斑病菌的特异性验证结果，M：DNAMarkerD；泳道1：大豆灰斑病菌；泳道2：大豆菌核病菌；泳道3：大豆紫斑病菌；泳道4：大豆疫霉根腐病菌；泳道5：大豆赤霉病菌；泳道6：大豆立枯病菌；图2为本专利技术所涉及的引物TF1/TR1对大豆灰斑病菌的灵敏度检测结果，M:DNAMakerD；泳道1：100ng/μL；泳道2:10ng/μL；泳道3:1ng/μL；泳道4:10-1ng/μL；泳道5：10-2ng/μL；泳道6：10-3ng/μL；图3为大豆灰斑病菌田间样品检测结果，M：DNAMarkerD；CK-:健康大豆样品；1,4,6,9：大豆灰斑病菌阴性样品；2,3,5,7,8：大豆灰斑病菌阳性样品。具体实施方式为进一步阐释本
技术实现思路
，下面对具体实施方式进行详细描述。实施例1：大豆灰斑病菌特异性分子检测方法的建立1.引物设计植物病原真菌分子检测中最常用的ITS序列在部分真菌种属间相似性很高，难以直接用于精确到种的鉴定工作。本专利技术通过对大豆灰斑病菌及其它植物病原真菌的ITS、β-tublin、Actin、Cytb、EF-1α等基因序列的多重比对分析，最终在β-tublin基因序列内发现多个大豆灰斑病菌特异性位点，并据此设计、筛选了大豆灰斑病菌特异性检测引物。通过GenBank数据库下载大豆灰斑病菌(Cercosporasojina)及Cercospora属其他种真菌的β-tublin基因序列，使用MEGA5.1软件进行多重比对分析，针对大豆灰斑病菌的特异性位点设计分子检测引物，所设计引物经Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在线特异性验证的筛选，最终获得大豆灰斑病菌特异性检测引物：上游引物TF1：5’-TGCTGCATTCTGGCAGACT-3’下游引物TR1：5’-ACCGGACATGACGGCAGAC-3’引物由上海生工生物有限公司合成。2.大豆灰斑病菌基因组DNA的提取采用SDS法提取大豆灰斑病菌的基因组DNA，具体方法如下：(1)收集大豆灰斑病菌菌丝体约20mg，在液氮中充分研磨成粉末，转移至1.5mL离心管中；(2)加入1mLSDS抽提缓冲液(3％SDS,50mMEDTA,50mMTris-HCl,1％β-巯基乙醇)，68℃水浴1h；(3)12000rpm离心10min，取600μL上清液，加入等体积的25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，混匀；(4)12000rpm离心10min，取500μL上清液，加入等体积的25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，混匀；(5)12000rpm离心10min，取400μL上清液，加入等体积的异丙醇，-40℃沉淀1h；(6)12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤2次并晾干；(7)加入100μLddH2O溶解，得到DNA样品。3.大豆灰斑病菌的分子检测以样品DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系包含：2.5μL10×PCR缓冲液，1.5μLMg2+(25mM)，0.5μLdNTP(each10mM)，2.5UTaqDNA聚合酶，上游引物TF1(10μM)和下游引物TR1(10μM)各1.0μL，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大豆灰斑病菌特异性分子检测引物，包括上游引物和下游引物，其特征在于：上游引物TF1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，下游引物TR1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种大豆灰斑病菌特异性分子检测引物，包括上游引物和下游引物，其特征在于：上游引物TF1，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示，下游引物TR1，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。2.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于，能够在大豆灰斑病菌中特异性地扩增得到769bp的目标产物。3.采用如权利要求1所述的检测引物PCR检测大豆灰斑病的方法，以待检测样本DNA为模板，其特征在于，进行PCR扩增，PCR反应体系为：2.5μL10×PCR缓冲液，浓度25mM1.5μLMg2+，浓度10mM0.5μLdNTP，2.5UTaqDNA聚合酶，上游引物TF110μM和下游引物TR110μM各1.0μL，DNA模板1.5μL，ddH2O16.5μL；PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋爽，张俊华，陈宇飞，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23