黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的InDel标记及其应用制造技术

本发明专利技术“黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的InDel标记及其应用”，涉及生物技术辅助育种领域。黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv紧密连锁的InDel标记，其中所述标记的引物的核苷酸序列为：InDel‑cmv3‑F/InDel‑cmv3‑R,所述InDel标记扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的特征条带223bp；所述InDel标记扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒病基因CMV连锁的特征条带为245bp；本发明专利技术获得的标记具有高效、限制少的优点，对选育抗黄瓜花叶病毒病的黄瓜材料提高了效率，缩短了育种周期。

InDel markers of cucumber mosaic virus disease gene CMV and its application

The invention \InDel marker and application of cucumber mosaic virus disease gene CMV\ and its application are related to the field of biotechnology assisted breeding. Cucumber cucumber mosaic virus resistant gene CMV InDel marker closely linked with the nucleotide sequence of primers labeled as: InDel cmv3 F/InDel cmv3 R, the InDel amplification and the characteristics of cucumber resistance to cucumber mosaic virus CMV gene linkage disease 223bp band; the InDel amplification and cucumber cucumber mosaic virus CMV gene sense chain characteristic bands for 245bp; mark obtained by the invention has the advantages of high efficiency, less restrictions on the advantages of cucumber disease breeding material resistant to CMV to improve efficiency, shorten the breeding cycle.

【技术实现步骤摘要】
黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的InDel标记及其应用
本专利技术涉及生物技术辅助育种
，特别涉及一种黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的InDel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。
技术介绍
黄瓜是重要的蔬菜作物之一，病毒病是影响黄瓜生产的主要病害，黄瓜花叶病毒(CMV)是引起病毒病的一种主要病原。黄瓜受到病毒病侵染后，初期新叶会出现明脉，后期叶片上有形状不规则的淡绿色或黄色斑点，即花叶症状，绿色部分极不平整，叶缘向外翻，叶片变窄，新叶上有疱斑，严重时叶片呈现皱缩畸形，植株矮化直至死亡。果实感病后，会出现螺旋状扭曲，瓜表面瘤状凸凹不平、畸形，果肉僵硬且味苦涩，产量和品质急剧下降。目前，国内外学者对黄瓜CMV抗性遗传规律研究较多，但由于所用试验材料、试验设计不同而对遗传规律有不同的观点。1961年，Wasuwat等研究发现黄瓜对CMV的抗性是由显性单基因控制的。1969年，Kooistra等在试验中得到了相互独立的3对抗CMV基因且都为显性。1997年，Wang等经过试验得到单一隐性基因对CMV的抗性起决定作用。黄焕焕(2007)等以抗CMV黄瓜材料‘F-3’和感CMV的材料‘HZL04-1’为亲本，构建F2群体，研究发现黄瓜对CMV的抗性是由细胞核基因决定的,受单一隐性基因控制。王军辉(2010)等利用F2群体研究表明黄瓜对CMV的抗性是由3个基因控制的。迄今为止，关于黄瓜CMV抗性QTL研究很少，仅王军辉对黄瓜CMV进行定位，共检测到17个控制CMV抗性的QTL位点，位于黄瓜第3，4，5，6染色体上。其中主效QTLcmv17位于SSRc68和SSR20218两个标记之间，遗传距离分别为5cM和0.5cM。由此可见，目前报道的与黄瓜花叶病毒病抗性连锁的标记只有SSR标记，并未见其他类型标记(如InDel、SNP等)的研究。
技术实现思路
基于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供了一种与黄瓜抗黄瓜花叶病毒基因cmv紧密连锁的InDel标记，并提供了该标记在筛选对黄瓜花叶病毒病抗病或感病的黄瓜种质资源上的应用。本专利技术的技术方案如下：一种与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记，其特征在于：所述标记的引物核苷酸序列如下：InDel-cmv3-F/InDel-cmv3-R:ATCCGTCGTGATTGTGAA/ATTTCGCTCCCAACACTC所述引物扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的特征条带为223bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；所述引物扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒病基因CMV连锁的特征条带为245bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。上述InDel标记在筛选具有抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的黄瓜种质资源中的应用，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用所述InDel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；所述标记的引物核苷酸序列如下：InDel-cmv3-F/InDel-cmv3-R:ATCCGTCGTGATTGTGAA/ATTTCGCTCCCAACACTC(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；(3)从检测结果中筛选出与抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记特征条带一致的材料，所述与抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记特征条带为223bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。优选地，所述PCR扩增的反应试剂按以下10μl反应体系的比例添加：1.5ng/μlDNA模板，所述引物正向和反向各5ng/μl，0.5μl/μlGoGreenMasterMix，其余为双蒸水。优选地，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。上述任一应用中，其特征在于，其中所述凝胶电泳检测，指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。一种用于筛选具有抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引物：InDel-cmv3-F/InDel-cmv3-R:ATCCGTCGTGATTGTGAA/ATTTCGCTCCCAACACTC。优选地，所述引物包含于PCR扩增预混试剂中，所述PCR扩增预混试剂中还含有Taq酶、dNTPs。本专利技术以黄瓜感CMV高代自交系‘65G’和黄瓜抗CMV高代自交系‘02245’为亲本构建的含140个株系的F9代RIL群体和含115个株系的DH群体为试验材料,通过苗期人工摩擦接种抗病鉴定技术,对黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv进行了遗传分析。以RIL群体为作图群体，利用SSR及InDel标记技术，进行遗传图谱构建,并结合构建的遗传图谱进行cmv基因定位研究，并获得与主效QTLcmv紧密连锁的InDel标记InDel-cmv3，与cmv的遗传距离为1.9CM。所述InDel标记特异性引物扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的特征条带为223bp，核苷酸序列如SeqIDNo.1；所述InDel标记特异性引物扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒病基因CMV连锁的特征条带为245bp，核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。本专利技术通过利用中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组选育的不同遗传背景的76份自交系和杂交种材料进行验证，结果表明InDel-cmv3验证的正确率为92.10％.本试验不仅为黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有抗黄瓜花叶病毒病基因的黄瓜新品种提供了高效的途径。本专利技术基于开发的InDel标记引物提供用于辅助筛选具有特定黄瓜花叶病毒病抗性的黄瓜新品种的方法，该方法中，采用所述InDel标记的特异性引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现三种情况：第一种是仅仅出现一条223bp条带，这种为隐型纯合材料(抗黄瓜花叶病毒病)；另一种是223bp条带和245bp条带都出现，这种是显性杂合材料(感黄瓜花叶病毒病)；第三种是仅仅出现245bp条带，这种为显性纯合材料(感黄瓜花叶病毒病)。通过本专利技术提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行黄瓜花叶病毒病抗性鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。附图说明图1.采用本专利技术所述的InDel-cmv3标记的特异性引物验证不同黄瓜材料的电泳检测结果；红色字体对应的泳道为表型与标记条带验证不一致的单株。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明，但并不限制本专利技术的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。生物材料的来源和记载出处本研究所用的试验材料为黄瓜感CMV高代自交系‘65G’和黄瓜抗CMV高代自交系‘02245’。以‘65G’为母本，‘02245’为父本杂交，获得F1，通过单粒传的方法获得包含140个株系的F9代RIL群体，通过大孢子培养技术获得包含115个株系的DH群体。65G(P1)：欧洲温室型黄瓜，雌性系，抗黑星病，霜霉病，白粉病，枯萎病，感病毒病：黄瓜花叶病毒，西瓜花叶病毒，番木瓜环斑病毒，小西葫芦黄化花叶病毒，为现有已知品种。在Walters和Wehner等人于1998年在《H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记，其特征在于：所述标记的引物核苷酸序列如下：InDel‑cmv3‑F/InDel‑cmv3‑R:ATCCGTCGTGATTGTGAA/ATTTCGCTCCCAACACTC所述引物扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的特征条带为223bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；所述引物扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒病基因CMV连锁的特征条带为245bp，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记，其特征在于：所述标记的引物核苷酸序列如下：InDel-cmv3-F/InDel-cmv3-R:ATCCGTCGTGATTGTGAA/ATTTCGCTCCCAACACTC所述引物扩增的与黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的特征条带为223bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；所述引物扩增的与黄瓜感黄瓜花叶病毒病基因CMV连锁的特征条带为245bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。2.权利要求1所述InDel标记在筛选具有抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的黄瓜种质资源中的应用，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用所述InDel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；(3)从检测结果中筛选出与抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记特征条带一致的材料，所述与抗黄瓜花叶病毒病基因cmv连锁的InDel标记特征条带为223bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。3.根据权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾兴芳，张圣平，苗晗，史利雪，王烨，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11