重组人干扰素α8多肽编码cDNA序列、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种重组人干扰素α８多肽及其在大肠杆菌中的表达和应用。本发明专利技术重组人干扰素α８是根据大肠杆菌密码子的偏爱性，经编码ｃＤＮＡ序列突变获得的。为提高目的蛋白表达水平、纯化效率，又对ｃＤＮＡ序列进行优化，进而构建大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０／ＩＦＮα８，经工程菌筛选，蛋白分离、纯化、冻干后获得。本发明专利技术重组人干扰素α８多肽可用于肿瘤或ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ等病毒感染性疾病的治疗。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
具体涉及重组人干扰素α-8(rhIFNα8)多肽编码cDNA序列及其在大肠杆菌中的表达和药物应用。
技术介绍
干扰素(Interferon，IFN)是由细胞分泌的一类具有抗病毒等多种生物活性的蛋白质。它通过直接或间接作用于细胞干扰素效应基因，表达多种效应蛋白，从而发挥多样性的生物学功能，作为一种细胞功能调节物质，干扰素属于细胞因子。经国际干扰素命名委员会正式确定名称的干扰素种类有IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNω、IFNτ等几种，同一型别的干扰素又分为若干亚型，其中IFNα研究最多。迄今为止，国内外学者已从人基因组中克隆了20余个IFNα基因。IFNα8基因先后由Yelverton E，Leung D，Weck P，et al.，(NucleicAcids Res 1981，9(3)731-741)Goeddel，D.V.，Leung，D，W.，Dull，t，J..，etal.，(Nature 1981，290(5801)20-26)Bowden DW，Mao J，GiU T，etal.，(Gene 1984，27(1)87-99)等作者于1981、1981、1984年克隆获得。研究表明，IFNα8基因定位于染色体9P22上，编码蛋白质产物为189个aa，其中前23个aa为信号肽，成熟的编码多肽为166个aa。专利技术者采用健康中国人外周血及胎肝组织标本为原料，经总RNA抽提，IFNα通用引物逆转录PCR(RT-PCR)，克隆获得了中国人IFNα8基因(见图1)，经序列分析比较与先前国外作者报道的序列完全一致，这为本专利技术的进行奠定了良好基础。有关IFNα8生物活性检测的研究亦见诸报道，其中较有代表的是Foster GR et al.，等的报道，研究表明，人IFNα8干扰素在IFNα各亚型中具有最高的抗病毒活性，且能诱导U1突变细胞株产生抗病毒状态。(Foster GR et al.，Different relative activities of humancell-derived interferon-alpha subtypesIFN-alpha 8 has very highantiviral potency.J.Interferon Cytokine Res，1996(12)1027-1033). FinterNB et al.，等采用WISH(人)、Hela(人)、MDBK(牛)、L929(小鼠)、RK13(家兔)、Vero(猴)等细胞株比较了IFNα1、α2、α8、αC、αF、Le等多种型别干扰素的抗病毒活性，结果IFNα8无论采用哪个系统，其抗病毒活性均属较高。研究发现，不同重组干扰素对NK细胞的促进作用有90倍的差异，其中α8(B)、α2(A)、α1(D)、αC较高，α6(K)、αF较低，α7(J)最低。(FinterNB et al.，J.Interferon Cytokine Res，1991(s)185.)迄今为止，国内外对于IFNα8的商业开发仍未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种可大量表达、纯化的，经突变、优化的IFNα8编码cDNA序列。本专利技术公开的rhIFNα8cDNA序列具有序列1、2所示的基因序列和编码氨基酸序列。该序列是在天然hIFNα8cDNA序列的基础上，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，在保证编码氨基酸序列不变的情况下，经突变后获得的。所述的rhIFNα8多肽分子量大小为20kda，pI值为4.9。本专利技术所要解决的另一技术问题是公开上述rhIFNα8在大肠杆菌中的表达方法。天然的IFNα8cDNA序列克隆于pBV220载体上，导入大肠杆菌DH5α，经检测，基因不表达。采用DNA软件分析发现，天然的IFNα8cDNA序列中含有许多大肠杆菌稀有密码子，推测这可能就是IFNα8不表达的主要原因。本专利技术根据大肠杆菌密码子的偏爱性，在保证编码氨基酸序列不变的情况下，人工合成了一段编码基因均为大肠杆菌偏爱的IFNα8cDNA序列(见序列1)。为了进一步提高目的基因表达水平，在IFNα8cDNA编码区起始密码子atg前还增加了一段核糖体结合位点序列(见序列3)。此外，在IFNα8cDNA序列的5’端引入了EcoR I酶切位点，3’端终止密码子(TAA)后增加了SalI酶切位点，进而构建大肠杆菌表达载体pBV220/IFNα8，经工程菌筛选，蛋白分离、纯化、冻干后获得目的蛋白。本专利技术rhIFNα8在大肠杆菌中的表达包括下列步骤一、大肠杆菌重组表达载体pBV220/IFNα8的构建1.IFNα8基因的亚克隆及与载体的连接首先将人工合成的IFNα8cDNA序列(序列1、2)及核糖体结合位点序列(序列3)亚克隆在pUC18载体上，成pUC18/IFNα8。用EcoRI/Sal I双酶切消化pUC18/IFNα8及大肠杆菌表达载体pBV220，回收IFNα8及载体片段。经纯化后，采用宝生物工程公司DNA连接试剂盒进行连接(见图2)，然后转化感受态大肠杆菌DH5α，LB平板过夜培养。2.工程菌筛选挑取LB平板上的阳性菌落进行酶切及测序鉴定。鉴定证实后的阳性克隆接种于5ml液体LB培养液中，30℃，250rpn/min培养12-18小时。将培养液转入50ml液体LB培养液中，继续培养至OD值为0.4-0.6，突然提高温度至42℃诱导4-5小时。离心收集菌体，进行SDS-PAGE电泳分析，结果获得了一株表达量很高的工程菌株。二、工程菌发酵条件的摸索及优化1.菌种的活化取-70℃、20％甘油保藏的菌种100ul，接种于含4ml LB培养基的试管中，加入氨苄青霉素使其终浓度为100ug/ml；32℃、220r/min培养10h左右，再按2％接种比例转种于含50mlLB的三角瓶中，加入氨苄青霉素使其终浓度为100ug/ml；32℃、220r/min培养4h，成为活化种子液，4℃保存。2.发酵种子液培养取活化的种子液，以1∶1000接种比例接种于含500ml LB培养基的1000ml三角瓶中，加入氨苄青霉素使其终浓度为100ug/ml。32℃、220r/min培养10h，OD600约为2.5。3.发酵罐培养使用New Brunswick Scientific公司的BioFloIII型7L自动控制发酵罐，发酵参数根据发酵液多参数监测结果及经验进行调整并优化。4.离心收菌得湿菌体5.菌体破碎三、重组蛋白IFNα8的分离、纯化1.包涵体的洗涤(1)用20mM Tris.cl pH8.0，1mMEDTA洗涤破碎菌体，9000rpm×30min，弃上清。(2)用0.2％Triton X-100，20mM Tris.cl pH8.0，1mM EDTA洗涤，9000rpm×30min，弃上清。经(1)、(2)洗涤，包涵体纯度可达到了60％左右。2.变性、复性、超滤(1)将洗涤好的包涵体以湿重计按1∶20(v/w)溶解于7M盐酸胍，50mMTris.cl pH8.0，10mM β-巯基乙醇，10mM EDTA缓冲液中，室温下搅拌4h，离心9000rpm×30min得透明上清液，即变性液。(2)将变性液采用稀释复性的方法进行复性，复性缓冲液为2.5MVre本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组人干扰素α－８，其特征在于具有下述基因序列：　　　　ＡＴＧ　ＴＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＴＣＴ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　４５　　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　　ＣＴＴ　ＡＴＴ　　ＣＴＴ　ＣＴＴ　　ＧＣＴ　　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　　ＴＧＴ　９０　　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＧＡＴ　ＣＧＴ　ＣＡＴ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＧＡＧ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　１３５　　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　　ＧＡＴ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＴＴＴ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＣＡＧ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＧＴＴ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＧＡＧ　１８０　　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　２２５　　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＴＴＴ　ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＣＴＴ　２７０　　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　　ＧＡＴ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＴＴ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＴＧＴ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴＴ　３１５　　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＣＴＴ　ＡＴＧ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＡＴＴ　ＣＴＴ　ＧＣＴ　３６０　　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苟兴华，陈守春，李伯刚，刘忠荣，韩雷，李德华，梁波，刘玉应，
申请(专利权)人：成都地奥制药集团有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]