一种溶解血栓的重组蛋白及其工程菌制造技术

本发明专利技术涉及一种应用基因工程方法改造尿激酶原，生产溶解血栓的重组蛋白及其工程菌。如右式该重组蛋白选择性地保留了尿激酶原分子活性部位的氨基酸序列，使之由原来的１２对二硫键减少为６对，但同样保持空间结构的稳定性和溶栓能力。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种应用基因工程方法改造尿激酶原，生产溶解血栓的重组蛋白及其工程菌。
技术介绍
血栓病已成为危害现代人类健康的重大疾病之一，仅我国每年就至少新增500万患者。血栓类疾病不仅发病率高，而且死亡率与致残率也很高，溶栓治疗是血栓性疾病的安全而有效的手段，因此溶栓和溶栓辅助药物的研制进展迅速。几十年来，从溶栓剂开始作为药物使用到现在，溶栓药物已经发展了三代第一代为尿激酶(u-PA)和链激酶(SK)，优点是溶栓效果强烈，缺点在于无纤维蛋白特异性，纤溶亢进。第二代为尿激酶原(pro-urokinase，pro-UK)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、乙酰化纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)等，具有纤维蛋白亲和性，出血副作用少，再通率高。但是容易再栓塞，且t-PA治疗颅内出血发生率较高。第三代为导向溶栓剂(抗体导向、磁导向、小肽导向等)，该类溶栓剂血栓特异性高、半衰期长、可减少用药量和副作用，正在开发和研制中。第二代尿激酶原的生物工程生产方法复杂，成本高。近年来，我国主要使用的溶栓药物还是以尿激酶为主。而尿激酶的生产依然停留在由人尿中提取，生产工艺非常繁琐，而且存在各种病原的潜在危险性。因此，利用基因工程技术，大量生产稳定高效具有导向性的溶栓药物，对于提高疗效和安全性、延长药物半衰期，以及降低生产成本有重要意义。
技术实现思路
为了降低成本，获得与天然尿激酶原活性相同，而生产工序简化的溶解血栓药物，本专利技术提供一种溶解血栓的重组蛋白，其特征在于T H C F I D Y P K K E D Y T V Y L G R S R L N S N T Q G E M K F E V E N L I L HK D Y S A D T L A H H N D I A L L K I RS K E G R C A Q P S R T I Q T I C L P SM Y N D P Q F G T S C E I T G F G K E NS T D Y L Y P E Q L K M T V V K L I S HR E C Q Q P H Y Y G S E V T T K M L C AA D P Q W K T D S C Q G D S G G P L V CS L Q G R M T L T G I V S W G R G C A LK D K P G V Y T R V S H F L P W I R S HT K E E N G L A L上述溶解血栓的重组蛋白的基因编码序列为ACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATG ACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTCTGATAG上述溶解血栓的重组蛋白可以采取以下方法获得由人细胞提取总RNA，根据尿激酶原分子活性中心两端的保守氨基酸序列，设计一对简并引物，Uf15’CTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAG 3’、Uf25’GAGAATCGTGCGGCCGCCTATCAGAGGGCCAGGCCAT 3’其中GCGGCCGC为Not I酶切位点，通过RT-PCR扩增获取在尿激酶原分子中去掉了N端143个氨基酸，以及151-157、179-184位氨基酸编码序列的sPA序列。选择性地保留了尿激酶原分子活性部位的氨基酸序列，使之由原来的12对二硫键减少为6对，但同样保持空间结构的稳定性。改造后的分子缺失了尿激酶原基因的生长因子类似区(EGF-LIKE DOMAIN)、环柄区(KRINGLE)、连接区、PAI-1因子(可以结合尿激酶使之失活，引起全身纤溶激活)结合位点，但保留了尿激酶原的活性区(sPA)。为了实现第三代导向溶栓剂，本专利技术可以这样进行在sPA序列5’端加上一段GZ1序列GGCCCCGTGGTGATTCTGGTTTGAAATTCCAGTGTGGTCAGGGTCCACGTCCATCTAAAATCATCGGT GGTGAATTCACCACCATTGAAAACCAGCCATGGTTCGCTGCTATCTACCGTGTTACCTACGTTTGCGGTGGTTCTTTGATCTCTCCATGCTGGGTGATCAGCGCC。该GZ1序列的功能为(1)可以识别、结合和活化血小板上最丰富的膜糖蛋白GP IIb/IIIa，所以它可以通过抑制纤维蛋白原与膜糖蛋白GP IIb/IIIa的结合从而抑制血小板的凝集，理论上在体内表现为抗凝，起到防止灌注后再栓塞的作用。(2)对纤维蛋白有亲和力，血栓中富含纤维蛋白，所以重组蛋白GZ1-sPA在体内对血栓亲和力较高。上述溶解血栓的重组蛋白序列的基因编码序列中的GZ1序列之氨基酸序列，其特征在于G P R G D S G L K F Q C G Q G P R P S K I I GG E F T T I E N Q P W F A A I Y R V T Y V C GG S L I S P C W V I S A通过基因工程方法获得了重组蛋白GZ1-sPA，该重组蛋白具有对纤维蛋白的高亲和力以及溶栓能力，因此有望成为新一代血栓导向溶栓药物。并且该重组蛋白在原核表达系统能稳定大量表达，其表达量远远高于其他表达系统中尿激酶原的表达量，因此通过基因工程能够工业化大量生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种溶解血栓的重组蛋白的氨基酸序列，其特征在于：Ｔ　Ｈ　Ｃ　Ｆ　Ｉ　Ｄ　Ｙ　Ｐ　Ｋ　Ｋ　Ｅ　Ｄ　Ｙ　Ｉ　Ｖ　Ｙ　Ｌ　Ｇ　Ｒ　ＳＲ　Ｌ　Ｎ　Ｓ　Ｎ　Ｔ　Ｑ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　Ｋ　Ｆ　Ｅ　Ｖ　Ｅ　Ｎ　Ｌ　Ｉ　Ｌ　ＨＫ　Ｄ　Ｙ　Ｓ　ＡＤ　Ｔ　Ｌ　Ａ　Ｈ　Ｈ　Ｎ　Ｄ　Ｉ　Ａ　Ｌ　Ｌ　Ｋ　Ｉ　ＲＳ　Ｋ　Ｅ　Ｇ　Ｒ　Ｃ　Ａ　Ｑ　Ｐ　Ｓ　Ｒ　Ｔ　Ｉ　Ｑ　Ｔ　Ｉ　Ｃ　Ｌ　Ｐ　ＳＭ　Ｙ　Ｎ　Ｄ　Ｐ　Ｑ　Ｆ　Ｇ　Ｔ　Ｓ　Ｃ　Ｅ　Ｉ　Ｔ　Ｇ　Ｆ　Ｇ　Ｋ　Ｅ　ＮＳ　Ｔ　Ｄ　ＹＬ　Ｙ　Ｐ　Ｅ　Ｑ　Ｌ　Ｋ　Ｍ　Ｔ　Ｖ　Ｖ　Ｋ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　ＨＲ　Ｅ　Ｃ　Ｑ　Ｑ　Ｐ　Ｈ　Ｙ　Ｙ　Ｇ　Ｓ　Ｅ　Ｖ　Ｔ　Ｔ　Ｋ　Ｍ　Ｌ　Ｃ　ＡＡ　Ｄ　Ｐ　Ｑ　Ｗ　Ｋ　Ｔ　Ｄ　Ｓ　Ｃ　Ｑ　Ｇ　Ｄ　Ｓ　Ｇ　Ｇ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　ＣＳ　ＬＱ　Ｇ　Ｒ　Ｍ　Ｔ　Ｌ　Ｔ　Ｇ　Ｉ　Ｖ　Ｓ　Ｗ　Ｇ　Ｒ　Ｇ　Ｃ　Ａ　ＬＫ　Ｄ　Ｋ　Ｐ　Ｇ　Ｖ　Ｙ　Ｔ　Ｒ　Ｖ　Ｓ　Ｈ　Ｆ　Ｌ　Ｐ　Ｗ　Ｉ　Ｒ　Ｓ　ＨＴ　Ｋ　Ｅ　Ｅ　Ｎ　Ｇ　Ｌ　Ａ　Ｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴文言，杨晓仪，林键，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]