巴曲酶基因的合成及其表达产物的纯化制备制造技术

本发明专利技术涉及一种基因重组方法制备的巴曲酶（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ），其关键是巴曲酶基因的合成、表达以及表达产物的纯化制备和性质确定。这种重组的巴曲酶既可以作为一种止血药的主要成分，也可以直接用作降纤药物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是有关采用重组DNA技术生产一种源于蝮蛇属毒蛇毒液中的巴曲酶(Batroxobin)蛋白，特别是巴曲酶基因的合成、表达以及表达产物的纯化制备和性质确证。
技术介绍
1963年奥地利学者Von Klobusitzky从巴西矛头蛇(Bothrops atrox)毒液中分离得到一种丝氨酸蛋白水解酶，也就是所谓的巴曲酶。从那以后，研究者已经从蝮蛇属不同毒蛇的毒液中得到了不下于二十种丝氨酸蛋白酶类分子，它们都能够酶切哺乳动物的血浆纤维蛋白原，使之转变为纤维蛋白，从而影响动物的出血-凝血过程。在这些蛋白酶中，尤其对巴曲酶的物理、化学性质与临床应用研究的较为清楚(Stocker K.，Barlow G.H.，Methods Enzymol.45214～223，1976)。巴曲酶的特异性作用底物是纤维蛋白原，与凝血酶不同的是，它只切割纤维蛋白原的A链，而不作用B链。当它水解血浆纤维蛋白原A链中的Arg16-Gly17位肽键时，能够释放出纤维蛋白肽A，从而快速地将血液中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，接着这些纤维蛋白就能聚集成疏松的易于被纤维蛋白酶水解的血栓来封闭伤口，实现快速止血的功效。不过，在使用较大剂量的时侯，巴曲酶有降低血中纤维蛋白原浓度，改善血液黏度和血液的流体力学特性，从而起到降纤酶的功效(US Pat.No3849252，1974)。基于这样一些生物化学特性，巴曲酶已经被成功地开发成止血药(商品名Reptilase或Hemocoagulase)和降纤药(商品名Defibrase)。在欧洲，巴曲酶正在替代人凝血酶作为止血药物。在国内，考虑到其分子的功能有类似凝血酶(Thrombin)之处，现中译名称为‘血凝酶’。早先也有‘蝮蛇血凝酶’、‘蛇凝血素酶’等说法。由沈阳赛诺、长春斯达、北京赛生和蓬莱华泰四家制药公司联合研制的‘立止血’仿制品‘巴曲亭’也已于2001年8月开发成功，该药(保护期为2001.8.21～2007.8.21)也是从蛇毒中提取制备而成。不过需要说明的是，根据英国药典(增补版)(MARTINDALE The Extra Pharmacopoeia，Thirty-first Edition，Edited by James E F Reynolds，Royal Pharma-ceutical Society，London，1996，P756)和默克索引(The Merck Index，1989，P1017)中描述，商品名为Reptilase(中文商品名为“立止血”)或Hemocoagulase的药物，其主要成分是巴曲酶，另外还含有凝血因子X激活物(Factor-X Activator，例如，RVV-X蛋白等成分)。虽然研究者对巴曲酶的性质有了比较多的了解，但是，对这种蛇毒成分的分子生物学研究一直进展缓慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成对巴曲酶基因的cDNA和基因组DNA测序工作(Nobuyuki Itoh etalJ.Biol.Chem.262(7)3132～3135，1987；J.Biol.Chem.，2637628～7631，1998)。1991年日本藤泽制药公司(Fujisawa Pharmaceutical)的研究者采用基因重组方法，在E.coli中，采用融合表达系统，以包涵体(Inclusion Body)的形式表达出该成分，再通过制备电泳和凝血酶切割开融合蛋白的方法据报道得到所谓有生物学活性巴曲酶(Maeda M etal，J Biochem(Tokyo)，109(4)632-637，1991)，而且还为此申请了专利(Pat.No.JP2124092，1990)。但是，自此后，只有从蛇毒中提取制备的巴曲酶用于治疗多种临床适应症(如，心肌梗死、老年痴呆、中风、突发性耳聋等等)的专利(USPat.No5595974，5869044，6106830，6399576，6416717；Eur.Pat.No0984279，0826374，0750912，0719791)和研究报告，再也没有重组巴曲酶用于动物试验和临床研究工作的任何相关研究报导。目前，国内对于巴曲酶药效学方面的研究报道颇多，尚未见对该成分进行重组表达的文献或报告。巴曲酶蛋白虽然只有一条肽链，但是由于分子内二硫键多，还有糖基化修饰等，所以采用基因工程手段生产这种蛋白有很大的技术难度。这也应该是这一直没有重组产品问世的主要原因之一。成熟的巴曲酶分子是由231个氨基酸残基组成的单链蛋白，理论计算出其分子量为25.5kD，等电点为7.39，国外从Bothrops atrox毒液中生物提取的巴曲酶的实际分子量为42kD，这种分子量的偏差是由于糖基化修饰缘故。从巴曲酶蛋白质一级结构中可以发现，其分子内有两个N-糖基化位点Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228。此外，Bothrops atrox的其它亚种以及其它种类毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不过其分子量从29.1kD到42kD不等，这可能是由于不同亚种之间氨基酸组成上差别或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12个半胱氨酸，根据已知的丝氨酸蛋白酶类分子的研究结果，推测这12个半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、Cys26-Cys42、Cys74-Cys230、Cys118-Cys184、Cys150-Cys168和Cys174-Cys199这六种分子内二硫键的形成。考虑到从蛇的毒液中提取巴曲酶的生产成本以及进一步研究其结构的需要，我们采用基因工程的方法生产重组巴曲酶。采用基因工程的手段生产富含二硫键的蛋白一直都是一个技术难题，尤其是生产有多对二硫键的丝氨酸蛋白水解酶类分子。这是因为二硫键配对错误率很高，在原核中得到的几乎全是包涵体，虽然通过对包涵体的变性-复性能得到少量有活性的目的蛋白，但是其成本决定了不具备实际生产意义。真核细胞表达系统(酵母、CHO和昆虫细胞等)中能保证较高二硫键配对正确率，因此本专利是采用甲醇酵母系统。我们在甲醇酵母(Pichiapastoris，Pichia methanolica)中成功地表达出了有生物学活性的巴曲酶蛋白，产量能达到每毫升发酵液20克氏单位(20KU/ml)，这一产量已经初步具备生产意义。根据美国Genebank中公开的巴曲酶(X12747)的氨基酸序列资料，选择酵母或E.coli都能较喜好的遗传密码子，人工合成巴曲酶全基因序列，分别将该基因插入到E.coli表达载体(如pET、pGEX类载体，用IPTG诱导；或pLY、PBV200载体，用热诱导；pLEX载体，用色氨酸诱导)中进行融合或非融合表达的研究；或插入到Pichia pastoris的分泌型表达载体pPIC9，pPIC9K，pPICZa类载体或pPIC3K类胞内表达载体，或插入到Pichia methanolica的分泌型表达载体pMETa类载体或pMET类胞内表达载体中进行分泌表达的研究。另外，也完全采用甲醇酵母喜好的密码子人工全合成巴曲酶基因，比较研究了这两个巴曲酶基因在表达产量上的差别。虽然在E.coli中表达某些蛋白已经是较为常规的生产药用蛋白的基本手段，但是在对巴曲酶蛋白的实际研究本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用基因重组的方法，由酵母、ＣＨＯ细胞等产生的糖基化或部分糖基化的巴曲酶，它具有使含抗凝剂的动物血浆凝固的特性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄秀东，陈佩新，肖建国，阮振兴，曾强松，潘学工，曹之舫，
申请(专利权)人：上海万兴生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]