甲醇酵母重组表达肝再生增强因子及其突变体制造技术

参考已经发现的人和鼠的几种肝再生增强因子（ＡＬＲ，Ａｕｇｍｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｌｉｖｅｒ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）的氨基酸序列和基因序列，人工合成人ＡＬＲ基因的关键性区段，并将其插入到甲醇酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达载体ｐＰＩＣＺａＡ中。实现在甲醇酵母中以分泌表达的方式生产具有医药用途的同源二聚体ＡＬＲ蛋白及其突变体ＨＲＦ等，所构造的甲醇酵母工程菌菌株上罐发酵时的表达产量不低于１．５ｇ／Ｌ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是要利用甲醇酵母(Pichia pastoris)表达系统重组人肝再生增强因子(Human Augmenter of Liver Regenerat ion，hALR)及其突变体，特别是人工合成hALR核心片段的基因序列，并对它的几种变异体也进行表达与活性比较。
技术介绍
自上个世纪六七十年代研究者就发现，刚断乳后大鼠的肝中，以及部分肝切除的成年大鼠和狗的再生期肝脏内、血液中都含有一类耐热(100℃，15分钟)并能刺激肝细胞增殖的成份，当时称之为肝细胞再生刺激物(Hepatocyte Stimulator Substance，HSS)。随后，大量的实验结果都表明，这类物质广泛存在于多种哺乳动物的再生期的肝、幼仔肝及胎肝组织中，它们与肝再生过程的调控密切相关(Tanigawa K.，etal.，JouralGastroenterol 35112-119，2000)。1994年，Hagiya M.等首先从大鼠中克隆了HSS中的一种成分的cDNA序列，初步阐明了它的基本结构，并将其定名为肝再生增强因子(Augmenter of Liver Regeneration)，简称ALR(Hagiya M.，etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 918124-8146，1994)。随着研究者对大鼠和人ALR基因的cDNA和染色体DNA序列研究的深入，已经先后确定了多种ALR亚型(Francavilla A.，etal，Hepatology 20(3)747-757，1994)。国内外的研究者对人和鼠的ALR的重组表达进行过比较多的研究工作，并申请了多项专利(参见美国专利5480797，5550037，5607844，5811397；中国专利97171932.0，99110801.9)。我国研究者于1990年前后，将从乳猪肝、新生小牛肝及人胎肝组织中提取的这类因子(例如，山东威海赛诺金公司的‘威佳’等)应用于临床重症病毒性肝炎的治疗，并取得了比较满意的疗效(Yao Z.，etalHepatology 121144-1151，1990；He R.，etal Hepatology 17225-229，1993)。最新研究结果表明，ALR是一种含FAD辅基的巯基氧化酶(Flavin-linked Sulfhydryl Oxidase)，它是通过遏制哺乳动物肝脏中的NK细胞的活性，从而间接地发挥促进肝细胞增殖功能的(FrancavillaA.，etal Hepatology 25(2)411-415，1997；Lisowsky T.，etal，Dig.Liver Dis.，33(2)173-80，2001)。虽然研究者对于ALR基因的转录、翻译以及分泌等过程尚不完全了解，分析其蛋白的一级结构序列信息也还不能确定其信号肽序列，但是，随着对其N-端基因测序工作的进一步深入，将有望揭开这个密。通过对人和鼠ALR的氨基酸序列分析比较后发现，其蛋白C-端一侧约118个氨基酸残基的序列高度恒定。据此，我们推测这部分序列应该是ALR这种细胞因子发挥生理作用的关键性部分，通过对重组制备的这种截短的ALR分子进行活性测定后发现，它们同样具有完整ALR的功能，所以，我们在本专利中将这种截短的ALR特称肝再生因子(Hepatic RegenerationFactor，HRF)(图1)。多年以来，通过对生物提取的HSS类成分的临床应用研究，以及对hALR的动物模型试验结果的观察均表明，经基因工程方法制备的hALR及其各种亚型，对肝切除手术(Hepatectomy)后的模型动物的肝再生有很好的促进作用。因此，重组制备的ALR对治疗急性肝功能衰竭、重症肝炎和肝纤维化等适应症方面可望有一定的临床应用价值。目前，所有国内重组ALR的工作都是在原核表达系统E.coli中完成的，目的蛋白以包涵体的方式产生，需要复杂的变性、复性过程。(参见贺福初等的中国专利97171932.0)。本专利描述了用甲醇酵母表达系统，以分泌表达的方式，成功地表达出了一种完整的hALR和它的两种突变体HRF和hmALR，其中hALR的Pichia pastoris菌株于2003年3月3日保藏，编号CCTCC NoM203012；HRF的Pichia pastoris菌株于2003年1月20日保藏，编号CCTCC NoM203007。
技术实现思路
1.hALR蛋白的核心功能区(HRF)及hrf基因的人工合成比较分析了现在已经发现的人和大鼠ALR的氨基酸序列(图1)，确认ALR分子C-端的118个氨基酸序列组成的肽段是相对恒定的部分，特称之为HRF。通过全基因合成的方法人工合成hrf基因。2.基因hALR的和hmALR获得最近公布人的一种ALR的基因序列(GenBank XM_034465)同另一种先前发现的人ALR相比较(GenBank AF146394)，仅在N-端7~12个氨基酸残基部分有明显的差别，而其余部分完全相同。因而，以hrf为模板，通过PCR法在hrf的5`-端添加这种12肽对应的DNA序列，就可以得到这种ALR亚型(XM_034465)，简称hALR。通过对hALR基因定点缺失突变，就可以得到hALR第12位缺失的突变体基因hmALR。3.表达载体的构建无论是hrf或者是hALR、hmALR，均可以通过PCR的方法在其5`-端增加XhoI酶切位点和Kex2酶切信号位点，在3`-端添加终止密码TAG和NotI酶切位点，将它们插入到表达载体pPICZαA的XhoI和NotI位点之间，这样就构建出了表达载体pPICZαA-hrf和表达载体pPICZαA-hALR，pPICZαA-hmALR(图2)。将这三种表达载体均用SacI酶切线性化处理，电转化甲醇酵母宿主菌X-33，在含抗生素Zeocin(500ug/ml)的YPD平板上筛选阳性克隆，进行增殖和表达筛选，得到高表达的工程菌(图3)。4.表达产物的活性测定参照Nakamura，T等的方法(Nakamura，T.，Araki，R.& Ichihara，AExp.Cell Res.179，488-497，1988)，通过同位素标记，用体外细胞培养试验来判定hALR及其突变体对肝癌细胞株(SMMC-7712)增殖情况的影响。根据刺激指数值(刺激指数＝实验组CPM/空白组CPM)来比较活性的差别。本专利正文中的ALR代表肝再生增强因子蛋白，hALR代表重组人的肝再生增强因子蛋白，其序列同GeneBank XM 034465公布的氨基酸序列组成，hmALR代表hALR的第12位精氨酸(R)缺失的突变体，HRF代表hALR的前12个氨基酸残基缺失的ALR蛋白，特称为肝再生因子蛋白，而采用斜体的hALR，hmALR和hrf分别代表这三种蛋白所对应的基因。附图说明图1.人和鼠的几种ALR氨基酸序列比较Hu代表人(Homo sapiens)的ALR，其中Hul是人的一种ALR(GenBankXM_034465)，而Hu2是人的另外一种ALR(GeneBank AF146394)序列；HM代表小家鼠(Mus musculus)的ALR序列(GeneBank NM_023040)。NR代表挪威本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过基因重组方法生产的同源二聚体蛋白，它具有加速肝细胞增殖，促进受损肝脏再生的功能。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄秀东，谈珉，陈佩新，肖建国，阮振兴，潘学工，曹之舫，
申请(专利权)人：上海万兴生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]