转外源基因技术提高黄芪甲苷含量制造技术

本发明专利技术公开了一种转外源基因技术提高黄芪甲苷含量的方法。本发明专利技术将透明颤菌血红蛋白基因（ｖｇｂ基因）经改造后，采用酶切结合ＰＣＲ技术，将ｖｇｂ基因插入质粒ｐＢＩ１２１，获得以３５ｓ－ＣａＭＶ强启动子为启动元件的中间表达载体ｐＢＩ１２１－ｖｇｂ，并转入大肠杆菌ＤＨ５α。采用三亲杂交法（ｐＲＫ２０１３、ＤＨ５α和ＬＢＡ９４０２），获得转ｖｇｂ基因的发根农杆菌ＬＢＡ９４０２－ｖｇｂ。用其侵染黄芪无茵苗，获得转基因黄芪毛状根，经测定其中黄芪甲苷含量高于未转基因毛状根含量５倍。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种转外源基因技术提高黄芪甲苷含量的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：１）质粒ｐＢＩ１２１的提取反应试剂的配制：ＬＢ液体培养基；溶液１为５０ｍＭ葡萄糖，２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，１０ｍＭ乙二胺四乙酸，ｐＨ８．０；溶液２ 为０．２ＭＮａＯＨ，１％十二烷基硫酸钠；溶液３为５ＭＫＡｃ６０ｍｌ，ＨＡｃ１１．５ｍｌ，无菌双蒸去离子水２８．５ｍｌ；酚∶氯仿∶异戊醇２５∶２４∶１混合液；核糖核酸酶２０μｇ／ｍｌ；无水乙醇；７０％乙醇；操作程序：取２ｍｌ含 抗生素的ＬＢ液体培养基，加入１５ｍｌ的通气良好的试管中，然后从转化平板上挑一单菌落，３７℃，３００ｒｐｍ，培养过夜；取１．５ｍｌ培养物，４℃，１２０００ｒｐｍ，离心０．５ｍｉｎ，倒去上清液，沉淀加１００μｌ溶液１重新悬浮细菌，剧烈震荡；加２００μｌ溶液２，盖紧盖子，快速颠倒混匀，置冰上；加１５０μｌ冰预冷的溶液３，盖紧盖子，颠倒混匀，置冰上３～５ｍｉｎ；１２０００ｒｐｍ，４℃，离心５ｍｉｎ，上清转移；加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，振荡混匀，４℃，１２０００ｒｐｍ，离心１０ｍｉｎ，转移上清液；在上清中加２倍体积乙醇，室温放置２分钟；１２０００ｒｐｍ，４℃，离心５ｍｉｎ；弃上清，沉淀；加１ｍｌ７０％乙醇洗涤，４℃，１２０００ｒｐｍ，离心１０ｍｉｎ，沉淀空气干燥１０ｍｉｎ；加５０μｌ含核糖核酸酶的无菌双蒸去离子水溶解脱氧核糖核酸，储存于－２０℃待用；２）双酶切：１０×双酶切缓冲液１０μｌ，限制性核酸内切酶ＸｂａＩ１０Ｕ／μｌ３μｌ，限制性核酸内切酶ＳａｃＩ１０Ｕ／μｌ３μｌ，脱氧核糖核酸１０μｇ，无菌双蒸去离子水３７℃水浴１ ｈｒ，取出７５℃灭活内切酶；取５μｌ电泳鉴定，其余部分酚∶氯仿∶异戊醇２５∶２４∶１萃取纯化后，加１／１０体积的３ＭＮａＡｃ，２倍体积的乙醇沉淀脱氧核糖核酸；静置１０ｍｉｎ后，１２０００ｒｐｍ，４℃，离心１０ｍｉｎ，沉淀用７０％乙醇洗涤 两次后晾干约１０ｍｉｎ，加适量的无菌水溶解，进行连接；３）感受态细菌的制备：从－７０℃低温冰箱取出大肠杆菌ＤＨ５α，接种于ＬＢ平板，３７℃培养过夜进行活化，从活化平皿上挑取单菌落，接入５ｍｌ不含抗生素的ＬＢ液体培养基中，３７ ℃振摇培养过夜２５０ｒｐｍ，次日按１％体积比转入新鲜的ＬＢ液体培养基中，３７℃振摇培养至ＯＤ６００＝０．３～０．６，在无菌条件...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜旻，胡之璧，王子艳，刘涤，周吉燕，倪跃元，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]