本发明专利技术属于制药领域，具体的说是一种新型的抗ＣＤ１６／抗黑色素瘤双特异性抗体Ｎ１Ｍ１及Ｎ２Ｍ２融合蛋白及其编码基因（在大肠杆菌中的表达和应用）。双特异性抗体Ｎ１Ｍ１融合蛋白，具有序列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４中氨基酸序列；其编码基因具有序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３中的核苷酸序列。双特异性抗体Ｎ２Ｍ２融合蛋白，具有序列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８中氨基酸序列；其编码基因具有序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７中的核苷酸序列。本发明专利技术双特异性抗体融合蛋白特异性激活巨噬细胞和ＮＫ细胞等在黑色素瘤周围对该肿瘤产生杀伤作用；为肿瘤的免疫治疗提供了新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于制药领域，具体的说是一种新型的抗CD16/抗黑色素瘤双特异性抗体N1M1及N2M2融合蛋白及其编码基因(在大肠杆菌中的表达和应用)。
技术介绍
长期以来肿瘤的临床治疗一直受到3大难题的困扰常规的放疗化疗方案选择性较差；肿瘤细胞产生耐药性；肿瘤发生微小转移。而肿瘤的免疫治疗无疑为解决这些问题提供了一条新的途径。自20世纪70年代中期kohler和Milstein成功建立单克隆抗体技术之后，这一疗法得到了广泛的研究和探讨。但是用单抗治疗实体瘤疗效不明显。因此，能导向药物和介导免疫细胞的双特异性抗体(Bispecificantibody，BsAb)成为近年来抗癌治疗的热点之一。双特异性抗体(BsAb)BsAb是一类具有双亲嗜性的组合抗体，又称双功能抗体(bifunctional antibody)，是指能结合两种特异性抗原的抗体分子。通过BsAb，即能将效应细胞与靶细胞有效地连接起来，启动效应细胞的生物学活性。所有的BsAb都是由两种不同特异性的抗体交叉连接而成的一个分子。根据抗体的来源和合成形式不同，BsAb分为以下几种类型和结构1.化学偶联法化学偶联法是将两个不同抗体的Fab片端通过偶联剂，氧化其硫基使之相连接成同源F(ab’)2BsAb，研究结果表明它们具有两种不同的抗原分子间结合的能力，在动物体内能动员效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞。但是缺点是新制备的BsAb在体内易被降解和消除。2.杂交杂交瘤制备法杂交杂交瘤法制备双特异性抗体是以传统的单克隆抗体技术为基础，将分泌两种抗体的杂交瘤细胞融合，使其能产生稳定分泌BsAb的杂交杂交瘤；该法制备的双抗生物活性高，抗体结构比较稳定，但是双杂交瘤细胞株在传代过程中稳定性较差，而且制备过程复杂，产量低，所表达的轻链、重链通过二硫键连接后组成十种抗体，其中只有一种为有生物学活性的BsAb，产物繁多，不易纯化。3.基因技术制备3.1基因工程抗体片段Fab’化学偶联成BsF(ab’)2；3.2细菌或细胞直接表达有生物活性的BsAb。目前具有良好基因工程双特异抗体的形式有单链双特异性抗体、双特异性双体(diabody)和双特异性微小抗体(miniantibady)等。本实验室将抗神经节苷脂GD2的单链抗体和抗CD16(FcγRIIIA)分子的单链抗体连接，形成一新型的单链双特异性抗体。神经节苷脂GD2是一类细胞膜上的糖鞘脂类化合物，其伸展于胞膜表面的糖基具有免疫原性抗原决定簇，能够诱发抗体反应。神经节苷脂对原发和转移的肿瘤有促进生长的作用。Liringston等(1987)指出黑色素瘤、成细胞纤维瘤、小细胞肺癌等肿瘤细胞表面大量存在神经节苷脂GD2。抗黑色素瘤单链抗体特异性结合黑色素瘤表面抗原-神经节苷质GD2的抗体，因此可以特异性识别黑色素瘤。特异性单链抗体NM3E2能特异性识别巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK)表面的表面分子CD16。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种双特异性抗体N1M1及N2M2融合蛋白及其编码基因。为实现上述目的，本专利技术采用基因技术的方法，将两种单链抗体(抗黑色素瘤单链抗体和抗CD16跨模型(FcγRIIIA)分子单链抗体)连接，制备了具有两种亲和性的BsAb，克服了化学偶联法杂交杂交瘤法的弊端，使大量生产有稳定生物学活性的双抗成为可能。一种抗CD16分子的单链抗体基因NM3E2，经设计的两组引物扩增后分别具有序列表SEQ ID No1 SEQ ID No5中碱基序列。抗黑色素瘤表面抗原GD2单链抗体基因M-ScFv(源于HB8759)经设计的两组引物扩增后分别具有序列表SEQ ID No2及SEQ ID No6中碱基序列。将两个基因通过重叠PCR法用Linker连接，所述融合蛋白基因具有序列表SEQ ID No4；SEQ ID No8中碱基序列。Linker相对应的肽分别为SerGly4Ser；(Gly4Ser)3。所构建的双特异性抗体，其作用原理是A)双抗首先结合黑色素瘤细胞，然后另一亲和效应NK细胞的臂抓住经过肿瘤表面的巨噬细胞和NK细胞，激活这两种细胞，对肿瘤产生杀伤作用。B)循环中的效应细胞巨噬细胞和NK细胞首先与双抗结合，然后随血液游走到黑色素瘤表面与其结合，激活的效应细胞对肿瘤产生杀伤作用。为肿瘤的免疫治疗提供了新的途径。本专利技术具有以下优点1.本专利技术利用重叠PCR(overlap-PCR)将抗GD2表面抗原GD2的单链抗体基因m-ScFv和抗CD16的单链抗体基因NM3E2融合在一起，得到新型的单链双特异性抗体基因n1m1、n2m2，双抗的联接肽序列分别为Ser Gly4Ser、(Gly4Ser)3，在肽连的C端引入了6×his以利于纯化。该双特异性抗体基因的序列经测序验证与设计相符后连接到表达载体pET-22b(+)上，然后导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)，用1.0mmol/L IPTG进行诱导表达，凝胶成像系统扫描显示表达的外源融合蛋白约占菌体总蛋白的25％。表达蛋白分泌于胞质空间，经超声波破胞后收集上清，经Ni+亲和层析柱分离，纯度可达90％以上。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定表达蛋白的分子量为54KD和53KD与预期的相符。构建的抗GD2/抗CD16单链双特异性抗体基因，为人工制备的新基因，属首次制得的融合基因。引入的连接肽片断不影响基因中可变区的结合作用。2.引用本专利技术，可进一步提供直接用于生产N1M1及N2M2(NM3E2-M-ScFv)融合蛋白的工程菌株。3.双特异性抗体融合蛋白特异性激活(识别)巨噬细胞和NK细胞(细胞表面上的CD16分子)等在黑色素瘤(表面抗原GD2分子)周围对该肿瘤产生杀伤作用(激活体内免疫系统，特异性杀伤黑色素瘤细胞)。为肿瘤的免疫治疗提供了新的途径。4.融合蛋白的大小是抗体分子的1/3，克服了单克隆抗体不易渗透到肿瘤组织的不足，抗肿瘤的作用更为明显。5克服了化学偶联法生产的双抗成本高、稳定性差、免疫原性强，而且分子量大不利于渗透到肿瘤部位等缺点。6克服了杂交杂交瘤法的弊端(例如有8种产物，杂交瘤容易老化，产量不稳定，传代操作复杂等)，生产双特异性抗体过程不会引入其他的副产物，便于分离纯化。7单链双特异性抗体是在DNA水平上将不同的的单链抗体片段的基因通过一段链间连接肽连接起来，直接表达成单链的双特异性抗体分子。由于不同特异性的抗体片段之间是共价连接，单链双特异性分子易于在各种表达系统中表达，且其稳定性好于其它的基因工程双特异性抗体，并且没有单体等副产物存在，更易于分离。附图说明图1为双特异性抗体N1M1(NM3E2-M-ScFv)的测序图谱之一；图2为双特异性抗体N1M1(NM3E2-M-ScFv)的测序图谱之二；图3为双特异性抗体N2M2(NM3E2-M-ScFv)的测序图谱；图4为双特异性抗体N1M1(NM3E2-M-ScFv)N2M2(NM3E2-M-ScFv)融合基因在大肠杆菌中的表达电泳图(SDS-PAGE图)；图中1-2为pET-22b/BL21(DE3)空白对照，3-4为n1m1/pET-22b/BL21(DE3)诱导表达，5-6为n2m2/pET-22b/BL21(DE3)诱导表达，7蛋白质分子量标准。具体实施例方式一.N1M1的置本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双特异性抗体Ｎ１Ｍ１融合蛋白，其特征在于：具有序列表ＳＥＱＩＤＮｏ：４中氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴文芳，倪剑锋，孙静，吕安国，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]
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