新的β－肌动蛋白和ＲＰＳ２１启动子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及新的β－肌动蛋白和核糖体蛋白Ｓ２１（ｒｐＳ２１）启动子的分离及应用。特别地，本发明专利技术的特征为包括仓鼠、大鼠和小鼠的啮齿动物β－肌动蛋白启动子和仓鼠ｒｐＳ２１启动子的序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及调节基因元件，如启动子及其应用，例如，在表达蛋白中的应用。更特别地，本专利技术涉及β-肌动蛋白和核糖体蛋白S21基因的启动子。
技术介绍
每种真核基因含有驱动该基因转录的调节元件。该调节元件包括典型地直接位于该基因编码区上游的启动子。作为转录机制的一部分，启动子通过提供转录因子的结合位点来调节转录。启动子通常被用于在细胞培养中和体内表达蛋白质。很多启动子是已知的并被用于各种表达系统中表达蛋白质。启动子的例子包括巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒基因组大基因组长末端重复(RSV)、猿病毒40(SV40)启动子、干扰素基因启动子、金属硫因启动子、和胸腺嘧啶激酶启动子及其它，如Fernandez等人(1999)在Gene ExpressionSystem，Academic Press中所描述的。然而，在本领仍需要提供一种可以产生高表达水平和/或在长时间内维持表达的启动子。β-肌动蛋白是一种结构蛋白，其通常在从原核到真核，包括人的所有物种中表达。先前描述了人和鸡的β-肌动蛋白启动子。一般而言，β-肌动蛋白启动子表现出比广泛被应用的CMV启动子更普遍的活性(Xu等(2001)Gene 272149-156)。仅仅当其被连接到CMV增强子序列时，鸡的β-肌动蛋白启动子比病毒CMV和SV40启动子具有更高的活性(Xu等，supra)。核糖体蛋白S21(rpS21)与核糖体40S亚单位有关。人的rpS21基因的启动子已被鉴别(GenBank接收号No.AJ250907)。与大多数核糖体启动子基因相似，其缺少传统的转录元件，如TATA盒和CAAT序列(Smirnova等(2000)Bioorg.Khim.26(5)392-396)。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的β-肌动蛋白启动子，其与前述公知的β-肌动蛋白启动子相比具有低水平的序列同源性(如，人或鸡)。本专利技术还提供了新的rpS21启动子，其与前述公知的rpS21启动子相比具有低水平的序列同源性(如，人或小鼠)。本专利技术部分基于对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)系来源的β-肌动蛋白和rpS21启动子的发现和分离。本专利技术进一步部分基于仓鼠β-肌动蛋白启动子比CMV启动子具有显著的高活性的观察。本专利技术进一步部分基于当被用于表达一定基因时，rpS21启动子至少具有与仓鼠β-肌动蛋白启动子相同的活性的观察。本专利技术提供了这些启动子的核酸序列，并包括具有启动子活性的各种核酸序列的变种。在一些实施例中，本专利技术的β-肌动蛋白启动子来源于啮齿类，如仓鼠、大鼠和小鼠。典型地rpS21启动子来源于仓鼠。本专利技术进一步提供了含有可操作地连接到异源核酸上的本专利技术的β-肌动蛋白或rpS21启动子的载体。在某些实施例中，本专利技术的载体包括可操作地连接到异源核酸上的启动子，该异源核酸编码异源表达产物，如治疗蛋白质或其片段。在示例性实施例中，表达产物是酸性鞘磷脂酶(ASM)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、或组织血浆酶原激活剂(tPA)。本专利技术还提供了用本专利技术的载体转染的宿主细胞。在描述性实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞，如CHO、HEK和BHK。本专利技术还提供了用于产生蛋白质的方法。产生蛋白质的方法包括，例如，培养转染细胞，该细胞用含有可操作地连接到编码蛋白质的异源核酸上的本专利技术的β-肌动蛋白启动子和/或rpS21启动子的载体转染的细胞，以及回收蛋白质。在一些实施例中，异源表达产物是分泌蛋白，其从培养基中被回收。在描述性实施例中，蛋白质是ASM、GAA、或tPA。附图说明图1A显示了仓鼠β-肌动蛋白启动子部分核苷酸序列(SEQ ID NO1)与大鼠β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO2)的比对，显示出SEQ IDNO1中的核苷酸487-893与SEQ ID NO2中的核苷酸1-417具有79％的同一性。大鼠β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO2)与仓鼠β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO1)的全长相比具有67％的同一性。图1B显示了仓鼠β-肌动蛋白启动子部分核苷酸序列(SEQ ID NO1)与大鼠β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO2)的比对，显示出SEQ IDNO1中的核苷酸1047-3006与SEQ ID NO2中的核苷酸546-2493具有83％的同一性。图2A显示了仓鼠β-肌动蛋白启动子部分核苷酸序列(SEQ ID NO1)与小鼠β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO3)的比对，显示出SEQ IDNO1中的核苷酸33-487与SEQ ID NO3中的核苷酸1-449具有84％的同一性。小鼠β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO3)与仓鼠β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO1)的全长相比具有80％的同一性。图2B显示了仓鼠β-肌动蛋白启动子部分核苷酸序列(SEQ ID NO1)与小鼠β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO3)的比对，显示出SEQ IDNO1中的核苷酸996-3006与SEQ ID NO1中的核苷酸921-2953具有83％的同一性。图3显示了仓鼠β-肌动蛋白启动子部分核苷酸序列(SEQ ID NO1)与仓鼠β-肌动蛋白基因(GenBank接收号No.U20114；SEQ ID NO4)的比对，显示出SEQ ID NO1中的核苷酸1775-3006与SEQ ID NO4中的核苷酸1-1232具有98％的同一性。仓鼠β-肌动蛋白基因序列与仓鼠β-肌动蛋白启动子序列(SEQ ID NO1)的全长相比具有40％的同一性。图4显示了仓鼠β-肌动蛋白启动子部分核苷酸序列(SEQ ID NO1)与在先已知的人β-肌动蛋白启动子(GenBank接收号No.gi28337；SEQ ID NO5)的比对，显示出SEQ ID NO1中的核苷酸113-148与SEQ ID NO5中的核苷酸38-73具有94％的同一性，SEQ ID NO1中的核苷酸362-433与SEQ ID NO5中的核苷酸303-374具有83％的同一性，SEQ ID NO1中的核苷酸1728-1764与SEQ ID NO5中的核苷酸1791-1830具有90％的同一性，SEQ ID NO1中的核苷酸1797-1966与SEQ ID NO5中的核苷酸1840-2007具有91％的同一性。仓鼠β-肌动蛋白启动子序列(SEQ ID NO5)与人β-肌动蛋白启动子(SEQ IDNO1)的全长相比具有10％的同一性。图5显示了仓鼠β-肌动蛋白启动子核苷酸序列(SEQ ID NO1)与先前已知的鸡β-肌动蛋白启动子(GenBank接收号No.gi217043；SEQ ID NO6)的比对，显示出SEQ ID NO1中的核苷酸1878-1919与SEQ ID NO6中的核苷酸186-227具有83％的同一性。鸡的β-肌动蛋白启动子序列(SEQ ID NO6)与仓鼠β-肌动蛋白启动子(SEQ IDNO1)的全长相比具有1％的同一性。图6A描述了CHO-K1细胞中的半乳糖结合蛋白、铁蛋白和β-肌动蛋白的RNA斑点印迹。mRNAs分别分离自放射菌素D处理后0、4、8、10和15小时后的细胞。图6B描述了半乳糖结合蛋白、铁蛋白和β-肌动蛋白的相对mRNA表达水平。mRNAs分别分离自放射菌素D处理后的CHO-K1细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选自ＳＥＱＩＤＮＯｓ：１、２、３的核苷酸序列的分离的啮齿动物β－肌动蛋白启动子或其具有启动子活性的变种。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：SD埃斯蒂斯，W张，
申请(专利权)人：建新公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]