本发明专利技术公开了一种RhoA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用。根据本发明专利技术的RhoA的RNA干扰靶点序列5’-GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’制备的RhoA?siRNA能有效的降低RhoA?mRNA的表达水平，高效下调前房组织中RhoA基因的表达量，影响应力纤维的形成，进而影响小梁细胞肌动蛋白细胞骨架结构和分布的改变，从而引起小梁细胞通道构型的变化，改变房水排出阻力，进而影响眼压，从而达到治疗青光眼的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及RhoA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用。
技术介绍
青光眼是目前全球第二位不可逆性致盲性眼病，它是一组以眼压升高或其他多种因素引起视神经损害，表现为视野损害、视盘凹陷扩大、视网膜神经纤维层萎缩的眼病。青光眼发生和发展的主要危险因素是高眼压的存在。青光眼的发病机制尚未完全阐明，小梁网部位房水外流阻力增大造成的病理性眼 压升高是引起原发性开角型青光眼的主要原因。小梁网细胞的生物学功能和构型依赖于肌动蛋白纤维及其结合蛋白组成的细胞骨架。Rho GTP酶是细胞骨架肌动蛋白微丝组建的重要调控因子，在肌动蛋白细胞骨架的调节中起核心作用。在哺乳动物中Rho亚家族按照其序列同源性分为6大类，其中以RhoA研究的最早也最为广泛。目前，抗青光眼的治疗包括使用房水形成抑制剂或增强巩膜葡萄膜流出的药物降低眼压，及改善滤过目的的手术治疗。而药物抗青光眼的方法已经显示出多种全身的和局部的毒副作用。目前，降低眼压的药物治疗主要有缩瞳药，肾上腺能受体激动剂，￠-阻断齐U，碳酸酐酶抑制剂，前列腺素衍生物等。例如，缩瞳药毛果芸香碱可以起视力模糊和其他不利的视觉副作用；碳酸酐酶抑制剂可引起恶心，消化不良，疲劳和代谢性酸中毒等全身毒副作用；￠-阻断剂对心脏兴奋和对支气管、骨骼肌血管的具有抑制作用。此类副作用可以导致患者适从性降低或终止治疗。鉴于青光眼的重要性及目前传统药物治疗的不当，针对青光眼发展基础性原因的基因靶向治疗越来越受到重视；然而，作为基因靶向性治疗手段之一的基因转染，其载体病毒载体的安全性及伦理性成为限制其临床应用的主要原因。例如，现在广泛使用的高效转染载体慢病毒载体，是人类免疫缺陷病毒-I (HIV-I)来源的一种病毒载体。由于HIV复杂的生物学特性，其安全性尚未得到很好的解决。RNA干扰是指生物中双链RNA诱导产生的一种特异的基因沉默现象。近几年来RNAi的研究取得了很大进展，使得这一技术迅速应用到多个研究领域，加速了对基因功能、遗传规律、信号转到机理的研究，并已将这一技术应用于癌症和病毒性疾病的基因治疗中，在眼科的应用研究也日益深入。Tolentino采用激光击破Br u ch膜建立脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)动物模型，米用玻璃体腔注射VEGF-siRNA后,观察血管生成情况及新生血管的渗漏，结果发现VEGF-siRNA能显著抑制CNV的生成，明显减少CNV的渗漏，且未观察到出血、炎症、毒性反应；Nakamii ra等采用结膜下注射磷酸盐缓冲盐水制作的眼内炎症和纤维化的大鼠模型中，发现大鼠模型中TGF-siRNA明显减少炎症反应和基质沉着。然而RNA干扰在眼部直接降低眼压治疗青光眼的应用及SiRNA前房注射后的分布情况却罕有研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供RhoA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用，所述的RhoA的RNA干扰靶点序列的核苷酸序列为5’ -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’。本专利技术提出的RhoA的RNA干扰靶点序列-RhoA siRNA选择有效靶序列的依据I、用RNA struct u re软件预测RhoA mRNA的二级结构,选择其中不形成发夹的片段,或者保证有十几个剪辑不形成发夹。2、片段19个碱基，有两个dT悬垂，同时GC含量在30% 55%，尽量避免GGG或CCC。3、检查序列的保守性，选择保守性高的。本专利技术的RhoA的RNA干扰靶点序列，其核苷酸序列如下5’ -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’。根据RhoA的RNA干扰靶点序列设计的RNA干扰序列RhoA siRNA，其正义链为5' GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3'，反义链为 3' dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG 5’。本专利技术以上述RhoA的RNA干扰靶点序列5’ -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’获得的RhoA siRNA,将该 RhoA siRNA 转染人小梁网细胞(Human trabecular meshwork)和小鼠·成纤维细胞NIH/3T3并检测其干扰效率，结果发现，如图I所示，RhoA siRNA能降低体外人小梁网细胞(Human trabec u Iar meshwork)和小鼠成纤维细胞NIH/3T3中RhoA基因的mRNA的表达，干扰效率可高达80%左右。将非特异性cy31abeled siRNA与转染试剂混合再注入前房，妥布霉素眼膏涂眼，用免疫荧光观察Cy31abeled siRNA在前房组织中分布情况，结果发现，如图2和图3A所示,绝大部分cy31abeled siRNA(图2中红色标记)存在于前房角的小梁组织中，而角膜内皮和虹膜组织中却未发现cy31abeled siRNA的分布，为进一步特异性基因治疗提供了实验基础。前房注射RhoA siRNA后ld、7d眼前节照相系统记录眼部角膜混浊，虹膜充血等情况，晶体透明度等情况，对于组织学观察，用石蜡切片染色观察角膜内皮形态，结果发现，如图3所示，RhoA siRNA在眼部未见明显的毒性反应，手术临床观察未见角膜浑浊，水肿，未见晶状体混浊。染色角膜内皮亦未见异常。在慢性高眼压小鼠动物模型的前房注射RhoA siRNA，检测术眼眼压变化情况和RhoA mRNA的水平，结果如图4和5所示，地塞米松局部点眼后，眼压逐渐升高，至第28天眼压升高约7mmHg，在RhoA siRNA注射后第5天，眼压降至正常基线水平。地塞米松引起的慢性高眼压小鼠动物模型的前房组织中的RhoAmRNA升高，在注射RhoA siRNA后，RhoAmRNA水平下降了约50%，在体内具有良好的转染效率。由此可见，体内注射特异性片段RhoA siRNA能高效下调前房组织中RhoA基因和基因的表达量，影响应力纤维的形成，进而影响小梁细胞肌动蛋白细胞骨架结构和分布的改变，从而引起小梁细胞通道构型的变化，改变房水排出阻力，进而影响眼压，从而达到治疗青光眼的目的。因此，本专利技术的RhoA的RNA干扰靶点序列5’-GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’可应用于制备治疗青光眼药物中。优选，根据所述的RhoA的RNA干扰靶点序列设计的RNA干扰序列RhoA siRNA,其正义链为 5' GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3'，反义链为 3' dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG5'，所述的治疗青光眼的药物是通过以下方法制备的用PBS将RhoA siRNA稀释成2iig/U 1，再按体积比3. 5 I. 5与转染试剂Lipofectamine RNAiMAX混合反应得到治疗青光眼的药物。根据本专利技术的RhoA的RNA干扰靶点序列5’ -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’制备的RhoA siRNA能有效的降低RhoA mRNA的表达水平，高效下调前房组织中RhoA蛋白的表达量，影响应力纤维的形成，进而影响小梁细胞肌动蛋白细胞骨架结构和分布的改变，从而引起小梁细胞通道构型的变化，改变房水排出阻力，进而影响眼压，从而达到治疗青光眼的目的。附图说明图I是SiRhoA的瞬时转染本文档来自技高网...
【技术保护点】
RhoA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用，所述的RhoA的RNA干扰靶点序列的核苷酸序列为：5’？GAAGTCAAGCATTTCTGTC？3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余敏斌，刘茜，吴开力，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：
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