本发明专利技术属于新植物技术领域。具体涉及一种适用于籼稻离体培养的分化培养基的制备及应用。本发明专利技术的特征是，在离体条件下先诱导籼稻外植体得到愈伤组织、再通过继代培养，最后将继代的愈伤组织转移到本发明专利技术所述的分化培养基，进而分化为完整的植株。培养基组分如下：ＫＮＯ↓［３］２８００－３０００ｍｇ／Ｌ，（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］３５０－４５０ｍｇ／Ｌ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］３００－４００ｍｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ１８０－２００ｍｇ／Ｌ，ＣａＣｌ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ１７０－２００ｍｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ４５－５５ｍｇ／Ｌ，６０－７４ｍｇ／ＬＮａ↓［２］ＥＤＴＡ，ＭｎＳＯ↓［４］.４Ｈ↓［２］Ｏ８０－１００ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ１５－２５ｍｇ／Ｌ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］２５－３０ｍｇ／Ｌ，ＫＩ６．０－８．０ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ↓［４］.５Ｈ↓［２］Ｏ０．２－０．３ｍｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］ＭｏＯ↓［４］.２Ｈ↓［２］Ｏ２．０－３．０ｍｇ／Ｌ，ＣｏＣｌ↓［２］.６Ｈ↓［２］Ｏ０．２－０．３ｍｇ／Ｌ，甘氨酸２．０－３．０ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ１］０．５－１．０ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ６］１．０－１．５ｍｇ／Ｌ，烟酸１．０－１．５ｍｇ／Ｌ，肌醇１００－１５０ｍｇ／Ｌ，谷氨酰胺３００－５００ｍｇ／Ｌ，脯氨酸５００－８００ｍｇ／Ｌ，麦芽糖３０－５０ｇ／Ｌ，６－苄基氨基嘌呤２ｍｇ／Ｌ，激动素２ｍｇ／Ｌ，吲哚乙酸０．２ｍｇ／Ｌ，萘乙酸０．２ｍｇ／Ｌ，植物胶５ｇ／Ｌ，ｐＨ为６．０。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于新植物
具体涉及一种籼稻的离体培养方法，更具体地说，涉及到籼稻愈伤组织继代和分化培养基的改良及其在籼稻离体培养和转基因中的应用。
技术介绍
培养基是植物离体培养方法的关键，任何植物离体培养方法的建立都主要是围绕培养基的筛选来进行。植物离体培养是室内人工模拟植物自然生长的过程，不同物种有不同的生长条件和环境，因此，可以想象，设计一种适合所有物种组织培养的培养基是不可能实现的，每种培养基都有其最适的物种甚至基因型范围。众所周知，目前已经广泛应用的几种经典培养基，由于其组分含量不同。其作用和效果也不相同。B5培养基(Gamborg OL等，1968.Nutrient requirements of suspension culture of soybean roots cells.Exp Cell Res，50150-158)主要适用于十字花科植物的离体培养；N6培养基(Chu CC等.1975.Establishment of an efficientmedium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources.ScientiaSinica，18659-668)主要适合于粳稻的组织培养；MS培养基(Murashige T，Skoog F.1962.Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures.Plant Physiol，15473-493)使烟草、番茄、马铃薯等茄科植物的离体培养变得十分容易和方便。这些培养基被称为植物组织培养的常用培养基而被沿用至今。上述这些经典培养基的组成一般是由基本培养基和附加成分组成，其中基本培养基主要包括无机盐(大量元素和微量元素)，维生素、甘氨酸和肌醇等有机营养成份，碳源等。植物激素和有机添加物，则是根据不同的培养目的、不同的培养对象和不同的培养时期进行调整的。对基本培养基的部分成分进行调整的培养基称为改良的基本培养基，如改良的MS、改良的B5培养基等等。至今，在籼稻品种离体培养过程中，愈伤组织不耐继代以及继代后愈伤组织难以分化仍是很突出的问题，这也是籼稻成为转基因的遗难物种的主要原因。因为现在用于植物转基因的任何成熟方法都是建立在植物离体培养方法基础之上，且需要一个较长时间的抗性愈伤的筛选和继代过程。目前，绝大多数关于籼稻品种离体培养过程中的愈伤组织继代和分化报道试验都是采用MS或N6培养基进行的，但使用这类培养基效果非常不能令人满意。主要问题是现有的继代的的愈伤组织生长速度很慢，而且愈伤组织的褐化严重，不能连续继代培养，从而导致整个试验失败。因此，筛选适合籼稻愈伤组织继代和分化的培养基，从而建立一种籼稻品种的离体培养方法对于籼稻的组织培养和转基因研究及其应用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种籼稻离体培养的方法，筛选适合于籼稻离体培养用的愈伤组织继代和分化培养基，这种新的培养方法和培养基，能够广泛地适应于离体条件下的籼稻组织培养和转基因的应用。本专利技术通过以下技术方案实现一种籼稻离体培养的方法，其步骤包括1)将去壳的成熟种子、幼胚或花药的籼稻外植体，置于75％酒精中清洗1分钟，0.15％升汞浸泡10-15分钟，无菌水漂洗，接入MS+2，4-D 2.5mg/L+谷氨酰胺300mg/L+脯氨酸500mg/L+3-5％蔗糖+0.3％植物胶(Phytagel)的培养基上，该培养基的pH为5.9，培养条件为26±1℃，暗培养，将所述的外植体诱导出愈伤组织；2)将步骤1)所得到的愈伤组织接入继代培养基(编号为J3)培养，该培养基的组分为KNO31900-2000mg/L，NH4NO31500-1650mg/L，KH2PO4150-170mg/L，MgSO4·7H2O350-370mg/L，CaCl2·2H2O 350-400mg/L，FeSO4·7H2O 35-42mg/L，Na2EDTA 50-56mg/L，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB10.5-1.0mg/L，VB61.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，2，4-D 2.0-3.0mg/L，麦芽糖30g/L，植物胶3.0g/L，pH为5.9，培养条件为26±1℃，暗培养，每隔20天继代一次；3)取步骤2)所得到的继代愈伤组织接入分化培养基(编号为DL3)，该培养基的组分如下KNO32800-3000mg/L，(NH4)2SO4350-450mg/L，KH2PO4300-400mg/L，MgSO4·7H2O180-200mg/L，CaCl2·2H2O 170-200mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，60-74mg/L Na2EDTA，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB10.5-1.0mg/L，VB61.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，麦芽糖30-50g/L，6-苄基氨基嘌呤2mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，植物胶5g/L，pH为6.0，培养条件为26±1℃，光照培养(16小时光/8小时暗)，再生出植株。一种用于离体培养的籼稻愈伤组织继代培养基(编号为J3)，其组分如下 KNO31900-2000mg/L，NH4NO31500-1650mg/L，KH2PO4150-170mg/L，MgSO4·7H2O350-370mg/L，CaCl2·2H2O 350-400mg/L，FeSO4·7H2O 35-42mg/L，Na2EDTA 50-56mg/L，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB10.5-1.0mg/L，VB61.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，2，4-D 2.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于籼稻离体培养的分化培养基，其组分如下所述：ＫＮＯ↓［３］２８００－３０００ｍｇ／Ｌ，（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］３５０－４５０ｍｇ／Ｌ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］３００－４００ｍｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ↓［４］. ７Ｈ↓［２］Ｏ１８０－２００ｍｇ／Ｌ，ＣａＣｌ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ１７０－２００ｍｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４.７Ｈ↓［２］Ｏ４５－５５ｍｇ／Ｌ，６０－７４ｍｇ／ＬＮａ↓［２］ＥＤＴＡ，ＭｎＳＯ↓［４］.４Ｈ↓［２］Ｏ８０－１ ００ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ１５－２５ｍｇ／Ｌ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］２５－３０ｍｇ／Ｌ，ＫＩ６．０－８．０ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ↓［４］.５Ｈ↓［２］Ｏ０．２－０．３ｍｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］ＭｏＯ↓［４］.２Ｈ ↓［２］Ｏ２．０－３．０ｍｇ／Ｌ，ＣｏＣｌ↓［２］.６Ｈ↓［２］Ｏ０．２－０．３ｍｇ／Ｌ，甘氨酸 ２．０－３．０ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ１］０．５－１．０ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ６］１．０－１．５ｍｇ／Ｌ，烟酸１．０－１．５ｍｇ／Ｌ ，肌醇１００－１５０ｍｇ／Ｌ，谷氨酰胺３００－５００ｍｇ／Ｌ，脯氨酸５００－８００ｍｇ／Ｌ，麦芽糖３０－５０ｇ／Ｌ，６－苄基氨基嘌呤２ｍｇ／Ｌ，激动素２ｍｇ／Ｌ，吲哚乙酸０．２ｍｇ／Ｌ，萘乙酸０．２ｍｇ／Ｌ，植物胶５ｇ／Ｌ， ｐＨ为６．０。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林拥军，张启发，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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