【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于非洲猪瘟检测领域，具体涉及非洲猪瘟多表位重组蛋白asfvmea及应用。
技术介绍
1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病，其临床症状主要表现为发热、皮肤充血发绀、内脏器官出血、呼吸障碍等，家猪病死率高达100％。asf是世界卫生组织(world health organization，woah)法定报告的动物疾病，也是我国一类动物疫病。
2、由于asfv的基因组庞大、变异迅速且有着复杂的免疫逃避机制，asf的疫苗研发面临着巨大的挑战，当前仍缺乏安全有效的非洲猪瘟商业化疫苗和治疗药物，目前对非洲猪瘟的防控主要依靠生物安全措施，以早期诊断与发现、隔离、扑杀等手段进行，快速准确的诊断对于控制非洲猪瘟病毒的传播至关重要。当前asfv诊断方法主要包括病毒分离、红细胞吸附试验(had)、荧光抗体试验(fat)、聚合酶链式反应(pcr)、实时荧光定量pcr(qrt-pcr)、重组酶聚合酶扩增(rpa)等，这些方法需要专业技术支持、成本较高且存在病原污染的可能性。酶联免疫吸附试验(elisa)是woah指定的诊断asf首选的血清学检测方法，可以检测血清和组织液，尤其是低致病力和非致死性毒株感染的猪能产生高水平的抗体，因此对诊断亚急性和慢性非洲猪瘟应用检测具有重要意义。因此，开发灵敏、特异且具有经济成本效益的血清学检测方法对于实现asf准确的诊断和监测至关重要。
3、当前
4、elisa检测方法构建成功的关键是具有高抗原特性、与抗体结合更敏感更特异的抗原靶点，asfv蛋白p30、p54、p72和pa104r蛋白均具有高度抗原性，常被用作包被抗原。p30蛋白，由cp204l基因编码，位于病毒内膜中，分子量为30kda。p30蛋白在感染后2-4小时内表达，是病毒早期诊断的重要靶点。由e183l基因编码的p54蛋白能够诱导强大的免疫应答也常用作检测抗原，p54蛋白抗体最早在感染后8天出现，基于p54蛋白的elisa抗体检测方法具有较高的灵敏度、特异性和稳定性。p72蛋白是asfv的衣壳抗原，具有很强的免疫原性，主要产生于病毒感染的后期，且在各毒株之间高度保守，通用于开发asf血清学诊断方法。pa104r蛋白是一种高度保守的类组蛋白样蛋白，表达于病毒中晚期，参与病毒的复制、转录和基因组的包装，具有较强的抗原性，可作为良好的igg和igm抗体反应性的靶标。因此本专利技术选择p30、p54、p72和pa104r蛋白作为靶标蛋白。
5、为获得更加准确的asf血清学检测结果，本专利技术选择了p30、p54、p72、pa104r蛋白的抗原表位，构建并表达纯化了asfv多表位重组蛋白，建立了间接elisa检测方法，以期获得具有更高的敏感性和特异性的elisa检测方法，可更好地应用于asf的检测与防控。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的非洲猪瘟病毒多表位重组蛋白(asfvmea)，该蛋白由非洲猪瘟病毒的p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白和pa104r蛋白的优势抗原表位构成，其氨基酸序列为seq id no.1所示。
2、本专利技术的另一个目的在于提供非洲猪瘟多表位重组蛋白asfvmea在制备非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中的应用。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施：
4、非洲猪瘟多表位重组蛋白asfvmea的获得：
5、通过iebd、svmtrip和bepipred 1.0server对asfv sy-18毒株(genbank登录号：mh766894.2)的p30、p54、p72蛋白的细胞表位进行预测分析，筛选出不同的抗原表位，将上述细胞表位进行多肽合成，然后与asfv阳性血清进行筛选，同时设立阳性和阴性对照，按照elisa结果最终一共筛选出15条细胞表位。组合并调整不同p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白、pa104r蛋白表位连接顺序，同时使用gggs和/或kk作为linker，以优化并筛选重组蛋白的最佳构建策略，最终获得了非洲猪瘟多表位重组蛋白asfvmea，其氨基酸序列为seq id no.1所示。
6、非洲猪瘟多表位重组蛋白asfvmea的原核表达方法，包括下述步骤：将seq idno.3所示dna片段连接至pet-30a(+)载体上，构建得到重组质粒pet-30a(+)-asfvmea，将测序正确的重组质粒pet-30a(+)-asfvmea转化到大肠杆菌bl-21(de3)中，进行诱导表达，即得目的蛋白。
7、本专利技术的保护范围还包括：
8、上述非洲猪瘟多表位重组蛋白asfvmea在制备非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中的应用。
9、以上所述的应用，所述的具体的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒为间接elisa抗体检测试剂盒，所述试剂盒中，重组蛋白asfvmea包被量为200ng/孔、包被液为pbs(ph7.4，0.01mol/l)、包被时间为37℃1h、封闭液为5％脱脂乳、封闭时间为37℃2h、血清稀释比例为1:200、血清孵育时间为37℃1.5h、酶标抗体稀释比例为1:10000、酶标抗体孵育时间为37℃1.5h、tmb显色时间为37℃15min。
10、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
11、1、本专利技术筛选并验证的抗原表位分别分布于蛋白的不同区域，能有效检测针对同一蛋白不同表位的抗体，具有较强的广谱性，有助于降低实际临床样品检测中假阴性的样本比例。
12、2、本专利技术尝试了多种多表位串联蛋白的构建策略，从中筛选出了一种蛋白表达效果最优、蛋白纯度相对最高、蛋白表面抗原暴露最充分且能够同时被相应蛋白抗体和asfv感染血清所特异性识别的构建策略，所构建的多表位抗原有优异的抗原性、特异性和灵敏性，能够更好的与抗体结合，提升asfv的抗体检测敏感性。
13、3、本专利技术选择了非洲猪瘟p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白和pa104r蛋白的优势抗原表位本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种人工合成的非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2. 权利要求1所述的非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA的原核表达方法，包括下述步骤：将SEQ ID NO.3所示DNA片段连接至pET-30a(+)载体上，构建得到重组质粒pET-30a(+)-ASFVMEA，将测序正确的重组质粒pET-30a(+)-ASFVMEA转化到大肠杆菌BL-21(DE3)中，进行诱导表达，即得目的蛋白。
3.权利要求1所述的非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA在制备非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述的试剂盒为间接ELISA抗体检测试剂盒。
5. 根据权利要求3所述的应用，所述的试剂盒的使用方式为：重组蛋白ASFVMEA包被量为200ng/孔、包被液为PBS、包被时间为37℃ 1h、封闭液为5%脱脂乳、封闭时间为37℃ 2h、血清稀释比例为1:200、血清孵育时间为37℃ 1.5h、酶标抗体稀释比例为1:10000、酶标抗体孵育时间为37℃ 1.5h、TMB显色时间
...【技术特征摘要】
1. 一种人工合成的非洲猪瘟多表位重组蛋白asfvmea，其氨基酸序列为seq id no.1所示。
2. 权利要求1所述的非洲猪瘟多表位重组蛋白asfvmea的原核表达方法，包括下述步骤：将seq id no.3所示dna片段连接至pet-30a(+)载体上，构建得到重组质粒pet-30a(+)-asfvmea，将测序正确的重组质粒pet-30a(+)-asfvmea转化到大肠杆菌bl-21(de3)中，进行诱导表达，即得目的蛋白。
3.权利要求1所述的非洲猪瘟多表位重组蛋白a...
【专利技术属性】
技术研发人员：王湘如，刘李鑫杰，陈启超，李亮，吴韦，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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