去饱和酶制造技术

本发明专利技术描述了以编码具有去饱和酶活性的酶的核酸分子转化的转基因细胞，及这些细胞和酶在生物催化中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及以编码具有去饱和酶活性的酶的核酸分子转化的转基因细胞，及这些细胞和酶在生物催化中的用途。去饱和酶是参与长链多不饱和脂肪酸(PUFA)合成的酶。PUFA是细胞发挥正常功能所必需的脂肪酸，且它们的营养性质为人们所熟知。PUFA的实例为二十二碳六烯酸(DHA)。DHA是n-3脂肪酸，它能直接从膳食中得到或来自膳食亚油酸和α-亚油酸的代谢。n-3脂肪酸与健康促进性能相关。例如，n-3脂肪酸被描述为消炎药物、抗血栓形成药物、抗心律不齐药物、低血脂症药物和血管扩张药物。因而，DHA在预防和/或治疗例如冠心病、高血压、II型糖尿病、眼疾、关节炎、囊性纤维病和精神分裂症的疾病中的作用成为大量医学研究的焦点。PUFA的生成涉及脂肪酰链的去饱和及延伸以产生花生四烯酸(20:4Δ5，8，11，14)和二十二碳六烯酸(22:6Δ4，7，10，13，16，19)的一系列连续过程。参与此代谢过程的几种去饱和酶已从包括三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、小眼虫(Euglena gracilis)和Pavlovalutheri在内的海洋微藻中分离到。这些膜结合的去饱和酶对于底物的链长和双键在脂肪酸上的位置有特异性。由于它们所引入的双键位于脂肪酸的羧基和预存键之间，所以它们属于前端脂肪酸去饱和酶类。这些去饱和酶在它们的N-末端含有细胞色素b5结构域，并含有在催化活性中重要的三个组氨酸基序。在本领域中，去饱和酶及编码去饱和酶的基因是已知的。例如，WO03/064596中除了其它方面以外，还描述了用ω3和δ12去饱和酶核酸分子转化的转基因细胞及这些细胞在脂肪酸生产中的用途。尤其是ω3去饱和酶在花生四烯酸到二十碳五烯酸的转换过程及δ12去饱和酶在油酸到亚油酸的转换过程中的用途。WO 03/099216也描述了真菌去饱和酶，尤其是经改造以表达真菌δ15去饱和酶的转基因植物。另外，US2003/0157144和US2003/0167525分别公开了dihomoylinolenic到花生四烯酸和亚油酸到γ-亚麻酸的转换中的δ5去饱和酶和δ6去饱和酶基因。此外，US2003/134400公开了δ4去饱和酶基因参与肾上腺酸到ω6-二十二碳五烯酸的转换和ω3-二十二碳五烯酸到二十二碳六烯酸的转换。这些稀有脂肪酸用于制药和化妆品组合物中，并且可作为基础营养脂肪酸。除通常在大多数活体中发现的16:0，16:1Δ9，18:0和18:1Δ9FA外，在广泛的种属范围内能发现微量的更多不常见脂肪酸。例如，在pavlova(巴夫藻)的几个种中，在Eustigmatophyte Nannochloropsisoculata(眼点拟微球藻)，在硅藻属的Phaeodactylum tricornutum和Thalassiosira pseudonana(海链藻)中已报道有16:1Δ11的存在。这种FA占这些微海藻类中总FA的很小一部分，并且还不了解它在海藻细胞内的特殊作用。但是这种FA在昆虫的性信息素合成中是很重要的前体。性信息素是种属特异性的不饱和脂肪酸(UFA)衍生物的混合物，这些衍生物具有不同的末端功能基和不同数量、位置和构型(Z或E)的双键，它们由不同的酰基-CoA去饱和酶产生。在现代Lepidoptera(鳞翅类)大多数性信息素成分的形成中，简单的单烯Δ11UFA是最普遍的前体。例如，在产生比例为30∶1的Z11-16∶Ald和Z9-16∶Ald的混合物的玉米穗夜蛾Helicoverpa zea中，最多的去饱和酶编码转录本是HzeaLPAQ(也被称为HzPGDsl)，它编码不含细胞色素b5延伸区的Δ11-去饱和酶，因而对该酶活性而言需要游离的细胞色素b5。具有不同专一性的许多酰基-CoAΔ11-去饱和酶已从昆虫中分离到，但是从其它种属分离不到。我们描述了显示Δ11-去饱和酶活性的细胞色素b5去饱和酶主要特性。根据本专利技术的一方面，提供了包含一种核酸分子的转基因细胞，所述核酸分子包含由图5a、5b、6a、6c、7a、8a、8b、9a、10a、11a、11b、11d所表示的序列组成的核酸序列，或核酸分子与这些序列杂交，其中所述核酸分子编码具有去饱和酶活性的多肽。在本专利技术的优选实施方案中，所述杂交条件是严格杂交条件。在本专利技术的优选实施方案中，所述核酸分子包括一种核酸序列，该序列与图5a、5b、6a、6c、7a、8a、8b、9a、10a、11a、11b、11d所表示的序列至少有30％的同源性。所述同源性优选与图5a、5b、6a、6c、7a、8a、8b、9a、10a、11a、11b、11d所表示的序列至少有40％、50％、60％、70％、80％、90％，或者至少有99％的一致性，并且其编码具有去饱和酶活性的多肽。去饱和酶核酸序列可经修饰以产生在细胞中表达增强的变体酶。例如，在微生物系统如酵母中，增加编码丙氨酸的密码子可促进重组表达。这些修饰在所有的表达系统中可能不是必需的，但有时是期望的。在本专利技术的优选实施方案中，所述核酸分子包括图5a、5b、6a、6c、7a、8a、8b、9a、10a、11a、11b、11d所表示的核酸序列。优选所述核酸分子由图5a、5b、6a、7a、8a、8b、9a、10a、11a、11b所表示的核酸序列组成。在本专利技术的进一步优选的实施方案中，所述细胞过量表达由所述核酸分子编码的所述去饱和酶。在本专利技术的优选实施方案中，所述过量表达相对于同种非转化参照细胞至少为2倍高。优选所述过量表达是相对于同种非转化参照细胞至少为3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或至少10倍高。在本专利技术的优选实施方案中，所述核酸分子是cDNA。在本专利技术进一步的优选实施方案中，所述核酸分子是基因组DNA。在本专利技术的优选实施方案中，所述转基因细胞以包含附图说明图10a所示的核酸序列并编码去饱和酶多肽的核酸分子转染，其中所述多肽具有Δ11-去饱和酶活性，或者以与图10a中的核酸分子杂交并编码具有Δ11-去饱和酶活性的多肽的核酸分子转染。在本专利技术的另一优选实施方案中，所述转基因细胞以包含图8a所示的核酸序列并编码去饱和酶多肽的核酸分子转染，其中所述多肽具有Δ6-去饱和酶活性，或者以与图8a中的核酸分子杂交并编码具有Δ6-去饱和酶活性的多肽的核酸分子转染。在本专利技术的优选实施方案中，所述转基因细胞是真核细胞。在本专利技术的另一优选实施方案中，所述转基因细胞是原核细胞。在本专利技术进一步的优选实施方案中，所述真核细胞是植物细胞。还提供了包括本专利技术所述的植物细胞的植物，及由所述植物产生的种子。在本专利技术的优选实施方案中，所述植物选自玉米(Zea mays)、芸苔(Brassica napus，Brassica rapa ssp.)、亚麻(Linum usitatissimum)、苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Seca cerale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)，向日葵(Helianthus annus)，小麦(Tritium aestivum)，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(Solanum tub本文档来自技高网...

【技术保护点】
转基因细胞，其包括含有图５ａ、５ｂ、６ａ、６ｃ、７ａ、８ａ、８ｂ、９ａ、１０ａ、１１ａ、１１ｂ、１１ｄ中所示的核酸序列的核酸分子，或与这些序列杂交的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有去饱和酶活性的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊恩格雷厄姆，蒂埃里托农，
申请(专利权)人：约克大学，
类型：发明
国别省市：GB[英国]