一种采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法：１．高分子真皮支架制备与修饰，２．从胚胎干细胞和皮肤组织制备表皮干细胞，３．制备原代人成纤维细胞，４．制备全层皮肤专用培养基，５．构建全层皮肤。本全层皮肤利用表皮干细胞分化增殖能力强的特点，构建的皮肤形态、组织结构和功能活性能满足亚慢性毒性检验的需要；人工合成的支架材料标准化程度高、批间差异小；皮肤构建全程采用无血清培养基，减少了影响组织构建的因素，为以后用于毒性试验奠定了基础。通过本发明专利技术制备的全层皮肤更接近于天然皮肤，其应用于毒性检验的方式和检测指标更符合实际情况，可以代替整体动物，直接应用于化学品、化妆品、药品等健康相关产品的皮肤毒性试验。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用干细胞组织工程技术构建全层替代皮肤的方法，可以用于替 代活体动物(或人体)皮肤用于毒理学试验领域。
技术介绍
皮肤是人体最大的器官，是外源化学因素(化学品、药品、化妆品等)或物理机 械因素(紫外线、微波等)毒性作用的主要器官。利用动物或人体皮肤进行皮肤毒性 测试是化妆品、药品、食品添加剂及原料、农药、生物制品、化学品健康安全评价的 常规检测项目。传统的皮肤安全性评价实验不仅要求一定数量和高质量的实验动物， 而且试验周期长，成本高，某些反应会给动物造成极大的痛苦。世界各国非常重视实 验动物的福利问题，如上世纪欧洲各国、美国颁布的动物福利法，中国的《实验动物 管理条例》等。随着国际动物保护和动物福利运动的兴起，40多年前国外最先提出了 以〃减少(reduce) 〃、 〃替代(r印lace) 〃和〃优化(refine) 〃为核心内容的"3R原 则"，并在此基础上大力开展动物实验替代方法的研究。特别是近20年，不再以动物 模式为基础的毒理学系统已被科学家采用，并被许多国家的政府、欧洲和国际法规所 接受。2002年11月7 H欧洲议会与欧盟理事会在布鲁塞尔达成协议，决定"从2009 年3月11 R起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏实验"，也"不允许 成员国从外国进口和销售进行动物实验的化妆品"。欧盟新化学品法规REACH (化学品 的注册、评估、许可和限制)也提出鼓励动物试验替代方法的开发和应用。采用体外 构建的组织工程皮肤进行毒性评价是动物试验替代技术的关键领域之一。组织工程化皮肤分为组织型表皮替代物、真皮替代物和器官型全层皮肤替代物几 类。1975年，Rheinwald和Green采用3T3成纤维细胞作滋养层，体外培养人自体表皮细胞获得成功(Rheinwald JG， Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinozytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 1975, 6:331-344)。美国Advanced Tissue Science公司生产的商品名 为Dermagraft的人工真皮以高分子材料PGA、 PGL网为基础，植入新生儿成纤维细胞 后培养成人工真皮替代物，结合自体表皮膜片用于临床移植(HarisbroughJF， Dore C， Hansbrough WB. Clinical trails of a living dermal tissue replacement placed beneath mesh， split-thickness skin grafts on excised burn wounds. J Burn Care Rehabil， 1992， 13:519-529)。美国Organogenesis公司生产的Testskin人工皮肤 模型，其表皮层由人角质细胞分化形成，真皮层由人成纤维细胞种植于I型牛胶原支 架构成 (Rodriguez H， 0'Connell C, Barker PE, et al. Measurement of DNA biomarkers for the safety of tissue-engineered medical products, using artificial skin as a model. Tissue Eng，2004， 10 (9—10):1332-1345)。 2001年2 月6闩伍津津等人申请了有关专利(中国专利申请号01107099. 4)，该专利技术包括胶原 凝胶的制备和细胞的三维培养等。2002年9月2日金岩等人申请了有关专利(中国专 利申请号02139398. 2)，该专利技术包括胶原凝胶的制备和全层皮肤的培养等内容。但这 几种皮肤替代物主要用于烧伤和溃疡、创伤等皮肤缺损病人的临床治疗，还不能替代 活体动物皮肤成熟用于皮肤毒性检验。作为组织工程皮肤也存在以下缺点人工表皮 由于不含真皮层，还不是真正意义上的人工皮肤；现有的含双层结构的人工皮肤组织 构造上还有待改进；培养周期长，皮肤功能在体外维持时间短，不适用于慢性毒性试 验。因此，用于毒性检验的皮肤不仅要求形态和组织结构与人体皮肤接近，而且要求 生理功能和活性与活体皮肤相似，构建的皮肤重复性好，批间差异小，便于毒性效应 的统计学分析。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题，就是提供一种利用诱导分化的表皮干细胞或原代分 离的表皮干细胞，采用筏式培养技术，制备毒性检验用全层皮肤的方法，该方法培养 周期短，皮肤含表皮与真皮双层结构，组织和结构与正常皮肤相似，功能和活性在体 外维持时间较长，能满足毒性检验领域的需要。实现本专利技术依次包括以下几个步骤 1、高分子真皮支架的制备与修饰1) PHBV支架制备:(a) 将3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物(poly,PHBV)溶于氯仿中制成浓度为120-130g/L的溶液，然后每 升溶液加入930-950g的氯化钠(NaCI)为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液；(b) 将浓浆液倒入孔径为0.8 1.0cm圆形金属模具中，待氯仿溶剂挥发约70-80% 后，从模具中取出成形支架，再置于通风橱内室温48-54小时晾干，25'C-35i:温度下， 1000 1300Pa真空范围内千燥2小时 3小时除去残余溶剂；(c) 将成形支架浸入去离子水中，每隔6-8小时换水1次，48-52小时内换水6-8 次直至将致孔剂滤除干净，室温晾干，25'C-35"C温度下，1000 1300Pa真空范围内干 燥24-48小时制成PHBV多孔三维支架；(d) 将PHBV多孔三维支架以无水乙醇浸泡l-2h，用波长254nm、 36W的紫外 线正反面各照射1.5-2h，无菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，无菌条件下自然晾干；2) 制备胶原-甲壳糖-硫酸软骨素-透明质酸修饰液(复合胶原修饰液) 按质量比例为14 16: 2 4: 1: 1制备原料I型胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、透明质酸A;在36W紫外灯照射下，用0.1%乙酸搅拌溶解I型胶原然后加入 甲壳糖，待甲壳素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的6-透明质酸 和硫酸软骨素A溶液，继续搅拌溶解3小时；使胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、透明质酸A最终浓度分别为7-8mg/ml、 l-2mg/ml、 0.5mg/ml和0.5mg/ml;然后在冰 浴条件下加入0.5ml 10XDMEM培养液，用lmol/L的NaOH快速调pH至7.2-7.3; 3)修饰PHBV支架将2)歩制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)步制备的PHBV多孔三维支架表 面，室温条件下静置20-30min，以此面为真皮面，在PHBV多孔三维支架的另一面, 用浓度为0. 4。/。的人源IV型胶原蛋白浸泡20-30min，此面为表皮面； 2、制备表皮干细胞采用两种途径获得表皮干细胞(ESC)，即从人胚胎干细胞定向诱导分化制备ESC 和从人皮肤原代分离培养制备ESC。1) 从胚胎干细胞定向诱导分化制备表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法，依次包括以下的步骤： Ⅰ、高分子真皮支架的制备与修饰 １）ＰＨＢＶ支架制备： （ａ）将３－羟基丁酸－ｃｏ－３－羟基戊酸共聚物ＰＨＢＶ溶于氯仿中制成浓度为１２０－１３０ｇ／Ｌ的溶液，然后每升溶液加入９３０－９５０ｇ的氯化钠为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液； （ｂ）将浓浆液倒入孔径为０．８～１．０ｃｍ圆形金属模具中，待氯仿溶剂挥发约７０－８０％后，从模具中取出成形支架，再置于通风橱内室温４８－５４小时晾干，２５℃－３５℃温度下，１０００～１３００Ｐａ真空范围内干燥２小时～３小时除去残余溶剂； （ｃ）将成形支架浸入去离子水中，每隔６－８小时换水１次，４８－５２小时内换水６－８次直至将致孔剂滤除干净，室温晾干，２５℃－３５℃温度下，１０００～１３００Ｐａ真空范围内干燥２４－４８小时制成ＰＨＢＶ多孔三维支架； （ｄ）将ＰＨＢＶ多孔三维支架以无水乙醇浸泡１－２ｈ，用波长２５４ｎｍ、３６Ｗ的紫外线正反面各照射１．５－２ｈ，无菌ＰＢＳ漂洗３－４次，每次２０－３０ｍｉｎ，无菌条件下自然晾干； ２）制备胶原－甲壳糖－硫酸软骨素－透明质酸修饰液： 按质量比例为１４～１６∶２～４∶１∶１制备原料Ⅰ型胶原、脱乙酰甲壳糖、６－硫酸软骨素、透明质酸Ａ；在３６Ｗ紫外灯照射下，用０．１％乙酸搅拌溶解Ⅰ型胶原然后加入甲壳糖，待甲壳素完全溶解后，再以１５－３０滴／分的流速加入预先溶解好的６－透明质酸和硫酸软骨素Ａ溶液，继续搅拌溶解３小时；使胶原、脱乙酰甲壳糖、６－硫酸软骨素、透明质酸Ａ最终浓度分别为７－８ｍｇ／ｍｌ、１－２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ和０．５ｍｇ／ｍｌ；然后在冰浴条件下加入０．５ｍｌ １０×ＤＭＥＭ培养液，用１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ快速调ｐＨ至７．２－７．３； ３）修饰ＰＨＢＶ支架： 将２）步制备的复合胶原修饰液均匀涂布于１）步制备的ＰＨＢＶ多孔三维支架表面，室温条件下静置２０－３０ｍｉｎ，以此面为真皮面，在ＰＨＢＶ多孔三维支架的另一面，用浓度为０．４％的人源Ⅳ型胶原蛋白浸泡２０－３０ｍｉｎ，此面为表皮面； Ⅱ、制备表皮干细胞 采用两种途径获得表皮干细胞（ＥＳＣ）： １）从胚胎干细胞定向诱导分化制备表皮干细胞 先制备羊膜片：无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含１００Ｕ／ｍｌ青霉素，１００ｕｇ／ｍｌ链霉素的ＰＢＳ冲洗干净血污，再转移到ＤＭＥＭ液中；然后在无菌环境下...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程树军，焦红，黄亚东，秦瑶，
申请(专利权)人：程树军，广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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