一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法，包括以下步骤：1.皮肤模型前期制备；2.树突状细胞的制备与培养；3.皮肤模型与树突状细胞共培养构建和受试物暴露；4.皮肤模型活性测试；5.皮肤模型基因组检测；6.共培养模型下层细胞分泌物检测；7.树突状细胞表面标志物表达检测；8.统计方法和结果预测。本发明专利技术把具有屏障和代谢功能的体外重建的3D皮肤与具有免疫功能的树突状细胞组合在一起，建立了共培养的新型实验系统，与体内具有相似的功能和致敏感反应；本发明专利技术可以从定性和定量两方面评价待测物质的皮肤致敏作用；本发明专利技术方法可代替活体动物和人体，直接预测化学品、化妆品、药品等可能导致的皮肤致敏。

【技术实现步骤摘要】
一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法
本专利技术属于皮肤致敏物质毒性检测和研究
，具体涉及一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法。
技术介绍
皮肤致敏，亦称之为接触性过敏性皮炎(AllergyContactDermatitis,ACD)，是皮肤对外源性物质产生的免疫原性皮肤反应。皮肤致敏的临床表现有瘙痒、红斑、丘疹和水肿等症状。对于大量生产的工业化学品，法规要求对其可能导致的皮肤致敏性进行检测；同样，对于可能皮肤接触的产品，包括化妆品、消毒类产品、卫生用品和医疗器械等，也应当对其可能引起的皮肤致敏进行评估检测。传统的方法采用豚鼠实验，通过诱导和激发两个阶段在动物皮肤涂抹受试物质，观察引起的皮肤症状进行判定，不仅需要大量标准化的实验动物，而且实验周期长，带给动物极大的痛苦。随着3R原则的推行，2004年OECD发布了小鼠局部淋巴结实验(LLNA)，以致敏发生后淋巴结内T细胞数量增殖变化代替动物临床症状观察，虽然减轻了动物痛苦，但仍然需要使用大量动物。近年来，在有害结局通路(AdverseOutcomePathway,AOP)毒性测试理念的指导下，快速高效的体外检测方法得到开发。其中皮肤致敏的体外预测方法开发最受关注。接触性过敏性皮炎属于人类的IV型超敏反应，基于有害结局通路(AOP)反应原理的皮肤致敏过程可分为：(1)外源物质渗透进入皮肤；(2)化学物质与表皮中的蛋白质结合，形成半抗原-蛋白复合物；(3)角质细胞氧化反应通路启动；(4)皮肤中的树突状细胞识别复合物，启动特异性反应；(5)成熟树突状细胞传递信号激活T淋巴细胞，产生记忆T细胞；(6)再次接触同类物质，淋巴结中的记忆T细胞快速增殖，产生特异性反应，皮肤出现相关症状。外源物质引起人体皮肤致敏的发生需要诱导和激发两个阶段，传统动物实验完整地模拟了这一现象。基于目前对于致敏发生机制的深入了解，可以针对上述过程的第(1)-(3)步建立检测方法。例如，针对第(2)步外源化学物质与表皮蛋白结合，建立了直接多肽结合反应(DPRA方法)，针对表皮细胞的第(3)步，有学者利用EpiskinTM完成了皮肤致敏体外方法的建立(FrancoiseC,ElodieB,ClaudeA,etal.Genesspecificallymodulatedinsensitizedskinsallowthedetectionofsensitizersinareconstructedhumanskinmodel.DevelopmentoftheSens-ISassay.ToxicologyinVitro,2015,29:787-802),针对第(4)步致敏物激活树突状细胞，建立了人免疫细胞活化实验(h-CLAT方法)。针对第(5)步体外T细胞检测，2013年6月26日M.林德斯泰特等人申请了有关专利(中国专利申请号201180062886.7)，该专利技术包括基于MUTZ-3细胞和基因阵列的皮肤致敏检测方法等。但是，这些方法仅仅只是针对皮肤致敏AOP过程中某一关键步骤建立的单一检测方法。然而人体皮肤并非简单地分解为各种细胞的组合，需要整合各个独立的细胞事件，最大化的利用检测过程中产生的所有毒理信息，获得完整的评估。所以，基于三维结构皮肤模型和树突状细胞的方法可用简单的系统，提供更全面和更科学准确的皮肤致敏反应信息。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题，就是提供一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养预测皮肤致敏的方法，利用体外的检测技术，完全不需要动物进行测试，更具代表性的使用了人源细胞，可以更接近人体的检测系统，高效和快速的进行毒性检验。解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法，其特征是包括以下步骤：步骤1.皮肤模型前期制备；步骤2.树突状细胞的制备与培养；步骤3.皮肤模型与树突状细胞共培养构建和受试物暴露：将购置或自制的皮肤模型孵育在一个与之大小匹配的6孔、12孔或24孔培养皿中：如果皮肤模型为吊篮式，将其直接悬挂于培养皿壁；如果皮肤模型为插入式，直接将其置于培养皿内；培养皿中已经添加2mL含酚红的MEM培养基，但无细胞；孵育在温度为37.5±0.5℃、湿度90±8％和5±1％CO2的培养箱环境中，时间为12-24h，备用；孵育结束后，将皮肤模型转移至与之大小匹配的6孔、12孔或24孔培养皿中，培养皿中已培养有树突状细胞，形成共培养体系；在皮肤模型表面直接进行受试物的处理，处理剂量为15-50μL，处理时间为15-60min；随后清洗皮肤模型表面受试物，并将皮肤模型与铺有细胞的培养皿一同孵育6±1h，每种受试物分别设置50％，10％，1％和0.1％四个浓度，每个浓度设置3组平行模型；待6±1h孵育结束后，将三组平行的皮肤模型按1:2的比例分别进行细胞活性测试和细胞基因组表达测试；共培养下层细胞进行细胞表面标志物检测和细胞分泌物检测；步骤4.皮肤模型活性测试；步骤5.皮肤模型基因组检测：将皮肤模型从固定支架取下，并将细胞层与支架层简易剥离，随后将两者放入准备好的TRIzol试剂中分离获取总RNA；将1μg总RNA加入含有随机引物的20μl总体积液体中，其中含有SuperScript反转录酶III，根据反转录仪器操作说明进行相关RNA的反转录；接着，利用寡核苷酸引物进行PCR扩增，最后通过电泳法检定基因的成分；鉴别皮肤刺激和皮肤致敏的候选基因组来源于下述表1中的基因群，具体的表面标志物分类为a组、b组和另外c-j组中任意至少1组：a)刺激基因组；b)凋亡基因组；c)减毒/解毒基因组；d)细胞死亡基因组；e)细胞应激基因组；f)热休克蛋白基因组；g)炎性基因组；h)MHC代谢基因组；i)蛋白酶体基因组；j)组织修复基因组；表1皮肤模型中用于判断皮肤致敏情况的基因群步骤6.共培养模型下层细胞分泌物检测；步骤7.共培养模型下层细胞表面标志物表达检测：取共培养下层细胞采用流式细胞仪进行细胞表面标志物检测，在流式细胞术之前，使用蛋白阻断剂对细胞的表面抗原进行非特异性阻断，以免干扰检测和结果，试剂保持在2～8℃，细胞所处的环境在暗室及温度在2～8℃；收集受试物作用后下层培养皿中的细胞，每孔分别移入相应的1mLEP管中，使用离心机离心收集细胞；并用缓冲液清洗一次，同样的条件下离心收集细胞；FcR阻断：使用FcR阻断剂附带说明书标明的浓度进行配制，随后将离心获得的细胞进行阻断，以消除非特异性结合对后期抗体表达量化检测的影响；抗体染色：将上述细胞根据细胞数量和抗体荧光标记选择特定的同型对照，随后根据试剂盒上的浓度提示进行抗体染色；流式细胞术或荧光酶标仪检测器检测抗体染色后的荧光强度：首先，对本批次细胞建立1组文件夹，包括实验组、同型对照组、溶剂对照组；然后，通过无处理的空白对照组细胞调节实验FSCvsSSC的实验电压，以确保本批次细胞后续实验的结果计算；再者，绘制FSCvsSSC和各组荧光组合的图，调节阳性组别的单染抗体下的电压补偿；最后，通过得到的图谱，分组获取相对荧光强度(RFI)值，计算公式如下：流式细胞术结果指标：荧光强度均值(MFI)＝荧光强度几何平均数；步骤8.统计方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法，其特征是包括以下步骤：步骤1.皮肤模型前期制备；步骤2.树突状细胞的制备与培养；步骤3.皮肤模型与树突状细胞共培养构建和受试物暴露：将购置或自制的皮肤模型孵育在一个与之大小匹配的6孔、12孔或24孔培养皿中：如果皮肤模型为吊篮式，将其直接悬挂于培养皿壁；如果皮肤模型为插入式，直接将其置于培养皿内；培养皿中已经添加2mL含酚红的MEM培养基，但无细胞；孵育在温度为37.5±0.5℃、湿度90±8％和5±1％CO2的培养箱环境中，时间为12‑24h，备用；孵育结束后，将皮肤模型转移至与之大小匹配的6孔、12孔或24孔培养皿中，培养皿中已培养有树突状细胞，形成共培养体系；在皮肤模型表面直接进行受试物的处理，处理剂量为15‑50μL，处理时间为15‑60min；随后清洗皮肤模型表面受试物，并将皮肤模型与铺有细胞的培养皿一同孵育6±1h，每种受试物分别设置50％，10％，1％和0.1％四个浓度，每个浓度设置3组平行模型；待6±1h孵育结束后，将三组平行的皮肤模型，取其中一组进行细胞活性测试，另外二组进行基因组表达测试；培养下层的树突状细胞进行表面标志物检测和细胞分泌物检测；实验设置对照组，包括溶剂对照和阳性对照；必要时增加基准物质对照；必要时，选择仅含皮肤模型或仅含树突状细胞的单一培养模型作为对照，用于比较共培养系统与单一培养系统在致敏预测能力方面的差异；步骤4.皮肤模型活性测试；步骤5.皮肤模型基因组检测：将皮肤模型从固定支架取下，并将细胞层与支架层简易剥离，随后将两者放入准备好的TRIzol试剂中分离获取总RNA；将1μg总RNA加入含有随机引物的20μl总体积液体中，其中含有SuperScript反转录酶III，根据反转录仪器操作说明进行相关RNA的反转录；接着，利用寡核苷酸引物进行PCR扩增，最后通过电泳法检定基因的成分；鉴别皮肤刺激和皮肤致敏的候选基因组来源于下述表1中的基因群，具体的表面标志物分类为a组、b组和另外c‑j组中任意至少1组：a)刺激基因组；b)凋亡基因组；c)减毒/解毒基因组；d)细胞死亡基因组；e)细胞应激基因组；f)热休克蛋白基因组；g)炎性基因组；h)MHC代谢基因组；i)蛋白酶体基因组；j)组织修复基因组；表1 皮肤模型中用于判断皮肤致敏情况的基因群...

【技术特征摘要】
1.一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法，其特征是包括以下步骤：步骤1.皮肤模型前期制备；步骤2.树突状细胞的制备与培养；步骤3.皮肤模型与树突状细胞共培养构建和受试物暴露：将购置或自制的皮肤模型孵育在一个与之大小匹配的6孔、12孔或24孔培养皿中：如果皮肤模型为吊篮式，将其直接悬挂于培养皿壁；如果皮肤模型为插入式，直接将其置于培养皿内；培养皿中已经添加2mL含酚红的MEM培养基，但无细胞；孵育在温度为37.5±0.5℃、湿度90±8％和5±1％CO2的培养箱环境中，时间为12-24h，备用；孵育结束后，将皮肤模型转移至与之大小匹配的6孔、12孔或24孔培养皿中，培养皿中已培养有树突状细胞，形成共培养体系；在皮肤模型表面直接进行受试物的处理，处理剂量为15-50μL，处理时间为15-60min；随后清洗皮肤模型表面受试物，并将皮肤模型与铺有细胞的培养皿一同孵育6±1h，每种受试物分别设置50％，10％，1％和0.1％四个浓度，每个浓度设置3组平行模型；待6±1h孵育结束后，将三组平行的皮肤模型，取其中一组进行细胞活性测试，另外二组进行基因组表达测试；培养下层的树突状细胞进行表面标志物检测和细胞分泌物检测；实验设置对照组，包括溶剂对照和阳性对照；必要时增加基准物质对照；必要时，选择仅含皮肤模型或仅含树突状细胞的单一培养模型作为对照，用于比较共培养系统与单一培养系统在致敏预测能力方面的差异；步骤4.皮肤模型活性测试；步骤5.皮肤模型基因组检测：将皮肤模型从固定支架取下，并将细胞层与支架层简易剥离，随后将两者放入准备好的TRIzol试剂中分离获取总RNA；将1μg总RNA加入含有随机引物的20μl总体积液体中，其中含有SuperScript反转录酶III，根据反转录仪器操作说明进行相关RNA的反转录；接着，利用寡核苷酸引物进行PCR扩增，最后通过电泳法检定基因的成分；鉴别皮肤刺激和皮肤致敏的候选基因组来源于下述表1中的基因群，具体的表面标志物分类为a组、b组和另外c-j组中任意至少1组：a)刺激基因组；b)凋亡基因组；c)减毒/解毒基因组；d)细胞死亡基因组；e)细胞应激基因组；f)热休克蛋白基因组；g)炎性基因组；h)MHC代谢基因组；i)蛋白酶体基因组；j)组织修复基因组；表1皮肤模型中用于判断皮肤致敏情况的基因群步骤6.共培养模型下层细胞分泌物检测；步骤7.共培养模型下层细胞表面标志物表达检测：取共培养下层细胞采用流式细胞仪进行细胞表面标志物检测，在流式细胞术之前，使用蛋白阻断剂对细胞的表面抗原进行非特异性阻断，试剂保持在2～8℃，细胞所处的环境在暗室及温度在2～8℃；收集受试物作用后下层培养皿中的细胞，每孔分别移入相应的1mLEP管中，使用离心机离心收集细胞；并用缓冲液清洗一次，同样的条件下离心收集细胞；FcR阻断：使用FcR阻断剂附带说明书标明的浓度进行配制，随后将离心获得的细胞进行阻断，以消除非特异性结合对后期抗体表达量化检测的影响；抗体染色：将上述细胞根据细胞数量和抗体荧光标记选择特定的同型对照，随后根据试剂盒上的浓度提示进行抗体染色；流式细胞术或荧光酶标仪检测器检测抗体染色后的荧光强度；首先，对本批次细胞建立1组文件夹，包括实验组、同型对照组、溶剂对照组；然后，通过无处理的空白对照组细胞调节实验FSCvsSSC的实验电压，以确保本批次细胞后续实验的结果计算；再者，绘制FSCvsSSC和各组荧光组合的图，调节阳性组别的单染抗体下的电压补偿；最后，通过得到的图谱，分组获取相对荧光强度(RFI)值；计算公式如下：荧光强度均值(MFI)＝荧光强度几何平均数；步骤8.统计方法和结果预测：将上述步骤获得的各组实验数据，以均数±标准差表示，采用SPSS22.0统计软件进行分析，多组之间差异的比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验法，显著性水平α＝0.05，P＜0.05表示差异具有统计学意义，使用FlowJo7.6对荧光强度进行统计分析；根据不同检测参数的意义，从统计结果分析，作出如下皮肤致敏预测：A.皮肤模型基因表达情况：实验组基因表达相对空白组增加2-7倍，即认为该物质在该浓度下可以引起该基因的显著性表达；实验组与空白组相比，刺激基因组别24个基因超过20个有显著性表达，可以认为该物质只具有皮肤刺激性，可不做后续致敏相关基因表达测试；另外的基因表达如果超过95％的基因呈现大于2-7倍的显著性增高，则可认为该物质在该浓度下有皮肤致敏潜能；B.共培养系统下层细胞分泌物检测情况：使用试剂盒进行检测期间，如有标准曲线，则标准曲线R2需要至少大于0.999，没有标准曲线情况下，阳性参照物组别相对空白组别，目的分泌物的减少或增加至少具有显著性的统计学差异；阴性参照物组别相对空白组别，目的分泌物的减少或增加至少具有显著性的统计学差异；待测物质处理后的细胞组别，根据实验情况，与空白组别进行统计学比较，根据统计学推断对结果的符合性进行判断；C.树突状细胞表面标志物预测：在细胞活率大于50％前提下，对于多数树突状细胞均具有的表面标志物中，CD86的相对荧光强度的均数与空白组相比增加大于1.5倍，CD54的相对荧光强度的均数与空白组相比增加大于2倍，该物质致敏性判断为阳性；其他情况下判断为阴性物质。2.根据权利要求1所述的基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法，其特征是：所述的步骤1皮肤模型前期制备包括以下子步骤：(1)对商业化三维皮肤模型：表皮模型、全层皮肤模型和含黑色素皮肤模型，根据商业化皮肤模型的操作程序对皮肤模型孵育，培养过程参考购置试剂盒时提供的培养程序；(2)对非商业化皮肤模型：实验室利用获取的来源于儿童包皮组织的原代角质细胞体外构建的三维重建表皮模型；使用包皮组织来源于5-11岁男童，分离培养角质细胞和成纤维细胞，构建的细胞应在3代以内；角质细胞接种于插入式培养皿中，培养皿底部是具有生物活性的支架材料，或是构建的含有成纤维细胞的人工真皮；角质细胞经12-14天气液界面培养生长成为多层的三维表皮或全层皮肤模型；要求符合体外重建三维皮肤模型的结构特征和功能特征，即分层的角质结构和屏障功能。3.根据权利要求1所述的基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法，其特征是：所述的步骤2树突状细胞的培养包括以下子步骤：(1)人源树突状细胞系和类树突细胞系选择人来源的连续传代的树突状细胞或类树突状细胞，包括U937、THP-1、MUTZ-3、KG-1、HL-60、MonoMac6、K-562和AML-193，细胞系细胞代数应为小于50代；从液氮罐中取出冻存细胞，溶解，加入培养基，吹匀，离心；移除上清，加入培养基混匀，转入25cm2培养瓶中，24h后观察细胞状态，查看细胞密度；如是悬浮细胞，至少1个星期通过离心去除残留废弃物并且计数；悬浮细胞密度在0.8-1.2×106/ml时需要传代；贴壁细胞以贴壁生长情况而定，于2-5天内进行一次传代；(2)外周血单核细胞分离和诱导的树突样细胞采集新鲜抗凝健康人外周血，肝素抗凝后，用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞；PBS洗去血小板，于37℃贴壁3h-4h后把上清移出到另一培养瓶中，以37℃预温的RPMI1640轻洗去除非贴壁的细胞，贴壁的粘附细胞即为单核细胞，再次37℃孵育3h，收取培养瓶中的细胞获得单核细胞；台盼蓝染色，于显微镜下计数活细胞数，细胞活率须>95％；调整细胞浓度为1×106个/L，接种于6孔培养板，每孔0.2mL，加入经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)100ug/L、重组人白介素-4(rhIL-4)100ug/L，然后置37℃，5％CO2培养箱内培养；每2天更换培养液并补充细胞因子，培养第5天加入重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)100ug/L，继续培养2d,，以促进DC成熟并维持细胞活性；培养第10天，收集贴壁细胞，采用倒置显微镜观察细胞形态；收集的细胞用PBS制成单细胞悬液，调整细胞密度至1×106/L，各测量管加入细胞悬液500ul，再分别加入用PE或FIT...

【专利技术属性】
技术研发人员：程树军，秦瑶，陈彧，柯逸晖，
申请(专利权)人：程树军，广州市华代生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44