本发明专利技术微生物涉及工程领域，具体涉及一种具有高稳定性和高水解功效的植酸酶及其编码基因以及包含该酶的宿主细胞和饲料添加剂。该植酸酶具有如下性质：比活高达３４５６±９７Ｕ／ｍｇ，良好的ｐＨ稳定性和热稳定性，最适ｐＨ ４．５，最适温度５５℃，强的蛋白酶抗性，且易于工业化发酵生产。本发明专利技术也涉及含有所述基因的重组载体，含有所述载体的宿主细胞，利用基因工程方法产生植酸酶的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物工程领域，具体涉及一种具有高稳定性和高水解功效的植 酸酶及其编码基因以及包含该酶的宿主细胞和饲料添加剂。
技术介绍
全世界的动物生产都是以植物性日粮为基础，而植物性日粮中都存在大量的 植酸，其中植酸磷占总磷量的50-70%，甚至更高。由于在消化道中植酸酶的活性 过低，因此单胃动物如鸡和猪、以及人类都不能利用植酸磷。这些未消化的植酸 螯合各种离子，如Ca2+、 Fe2+、 Zn2+和Mg2+，降低了这些重要矿物元素的吸收利 用。同时消化道中的植酸还与摄取的蛋白质、淀粉等营养物质形成复合物，阻碍 相关消化酶的作用，影响这些营养物质的消化吸收。此外，在畜牧业生产集中的 领域，大多数未被消化的植酸磷排泄到周围环境中会污辯水源和其他生态系统， 带来了严重的环境问题。植酸酶(肌醇六磷酸酶；EC 3.1.3.8和3.1.3.26 )是一类能够从植酸中水解 释放无机磷的酶的总称。为了充分利用植酸磷和被植酸螯合的养分，微生物来源 植酸酶首次被添加到以玉米、豆粕为基础的鸡的日粮中，用于水解植酸，解除植 酸的抗营养作用，并且取得了明显的效果。然后，大量的实验表明，向单胃动物 日粮中添加微生物来源的植酸酶，可提高磷的利用率，提高动物的生长速率。同 时，补充植酸酶也提高矿物元素的活性，减少磷的排泄量高达50%，这将有助于对 环境的保护。动物实验已阐明了动物的胃是真菌和细菌植酸酶从植酸中释放无机磁的主要 功能部位。为了提高植酸磷的利用，饲料中的植酸酶必须具有强的催化活性，然而，在胃内，pH值从摄入食物后，先是急剧上升至5.5，其后慢慢减低到2.0。胃 蛋白酶的前体在酸性条件下会被分泌的盐酸激活，具有强的蛋白水解能力。因此， 植酸酶必须抵制酸性条件下的变性，蛋白质的水解，并且在生理温度和酸性条件 需要具有高的活性。目前，黑曲霉植酸酶和大肠杆菌植酸酶已被广泛地应用于饲料工业，以改善磷 的利用率，减少磷对环境的污染。然而在消化道中的水解能力，它们与"理想植 酸酶"还有一段差距。为了接近"理想植酸酶"，商业酶的性能，如在酸性pH值 下的催化功效和稳定性，以及胰蛋白酶抗性等，都需要通过蛋白质工程的方法加 以改进优化，或者找一些性质更优良的植酸酶取而代之。在过去十年中，已有多 种微生物的植酸酶被分离定性。此外，在植酸酶的研究中的一个重要趋势是筛选 分离性质更优良的植酸酶。由于目前使用的植酸酶存在的一些缺陷，不能真正在胃肠道中充分发挥功能， 因此，人们希望能够找到这样一种新的植酸酶其具有非常好的稳定性，在动物 胃肠道中有非常高的活性，并且该植酸酶还能够通过发酵技术大量生产，这样可 以使其成本大幅度的降低，从而能够进一步推广该植酸酶的使用。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人为了解决上述问题提出并完成了本专利技术。 本专利技术的目的是提供一种具有高稳定性和高水解功效的植酸酶。 本专利技术的再一目的是提供编码上述植酸酶的基因。 本专利技术的再一目的是提供含有上述基因的DNA重组载体。本专利技术的再一目的是提供含有上述基因的宿主细胞。 本专利技术的再一目的是提供含有上述酶的饲料添加剂。根据本专利技术的植酸酶，其具有如SEQIDN0.1所示的氨基酸序列，其理论分 子量46.1kDa，最适pH在4-5之间，最适温度在50-60。C之间，比活在2400 U/mg 以上，在pH1.5 5.5之间都具有高的活性，且在pH 1 10之间都具有良好的pH稳 定性。在人工胃液中具有良好的稳定性和强的植酸水解能力。所述植酸酶可分离 自耶尔森菌属微生物(&wZ"ia)，优选为罗氏耶尔森菌(;reW"iara/7^i)。本专利技术还提供了编码上述植酸酶的基因，优选地，其具有如SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。 因此，本专利技术提供的植酸酶可以是a) 具有SEQIDNO. 1所示氨基酸序列的多肽；或b) 由SEQ ID NO.l所示的多肽序列经过1 10氨基酸的取代、缺失和/ 或插入衍生且具有植酸酶活性的多肽；或c) 由SEQIDN0.2所示的核酸分子或其简并序列所编码的多肽；或一d) 由在严谨条件下与SEQ ID N0.2所示核酸分子的互补链杂交的核酸 编码且具有植酸酶活性的多肽；或e) 与SEQ ID NO.l所示的多肽序列具有至少70%同源性且具有植酸酶 活性的多肽。具体地，本专利技术的植酸酶可由SEQ IDNO.l所示的多肽序列经过一个或 多个(例如， 一个或儿个，包括具体的点值，可以是1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10，或者是处于中间的任一范围，如2-3个、7-8个等等)氨基酸的 取代、缺失和/或插入获得，并仍然具有植酸酶活性。例如， 一个常见的策 略是保守氨基酸取代，即将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。 .具有相似侧链的氨基酸残基在本领域己有明确定义。再如，本领域技术人员公知，在基因的克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表 达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活 性。又如，在重组蛋白的表达策略中，为构建融合蛋白、令重组蛋白分泌到 胞外、增强其表达、便于纯化或纯化后与融合部分分离等目的，常常需要将 一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或其它合适区域内，例如， 包括但不限于，接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、 麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、 6His标签、Flag标签、或蛋白水解酶(如Xa 因子、凝血酶、肠激酶)识别位点等等。另外，本领域普通技术人员将会理解由于自然变异所致的遗传多态性 可在群体中的个体间存在。此类自然变异所产生的等位基因或天然变体一般 可在植酸酶基因核苷酸序列中导致1~5%的差异。任何这种自然变异产生的 等位基因或天然变体所编码的相应植酸酶蛋白活性不改变的此类氨基酸多 态性也在本专利技术的范围之内。也就是说，本专利技术也涉及由SEQIDN0.2所示 核酸分子的等位基因或天然变体所编码的具有植酸酶活性的多肽。另外，植酸酶蛋白可以为这样的活性多肽，.优选地，其包含至少83%、 84%、 85%、 86%、87%、 88%、或89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%, 更优选地，包含至少95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更高地同源于本专利技术 SEQIDNO.l所示的全长氨基酸序列的氨基酸序列，且其具有植酸酶活性。 除上述具体点值之外，上述值中间的范围和同一性值也包括在本专利技术中。例 如，也包括使用任一上述值作为上限和/或下限组合而成的同一性值范围。 在两个序列间比较序列并确定百分同源性为本领域公知的技术，可利用任何 数学算法完成，既有作为软件可商购获得的，也有整合在公共数据库中的， 例如多序列比对程序CLUSTAL W和模块分析程序BLOCKS,或NCBI的 GenBank中所采用的BLAST服务器http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST等。本领域普通技术人员将明了针对所分析的具体序列如何优化各程序中相应 的参数设置(如分值、字长、缺口罚分、权重等等)，可以获得预期的同源 性或同一性比对结果。利用GenBank中BLAST的缺省参数设置，本专利技术植 酸酶蛋白与其它已知家族成员的序列比对结果如下表1:本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新的植酸酶，其特征在于，具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，黄火清，罗会颖，杨培龙，王亚茹，孟昆，于会民，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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