一种壳聚糖衍生物制备方法及其在食品保鲜中的应用技术

本发明专利技术公开了一种壳聚糖衍生物制备方法及其在食品保鲜中的应用。一种壳聚糖衍生物的制备方法，壳聚糖衍生物是通过壳聚糖粉末在含有酚酸类化合物和重组细菌漆酶的反应液中，60‑85℃温度条件下反应0.5‑4h而得；所述的酚酸类物质选自阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、五倍子酸、没食子酸、儿茶素、单宁酸、茶多酚中的任意一种。本发明专利技术中的细菌漆酶催化合成壳聚糖衍生物的制备方法与化学方法相比，具有环境友好的优势，属于一种绿色生产方式。并且使用的重组细菌漆酶具有良好的热稳定性，催化反应液能够多次重复利用。本发明专利技术所述的壳聚糖衍生物在果蔬、肉制品、奶制品、油脂类制品等各类食品具有良好的保鲜效果。

Preparation of a chitosan derivative and its application in food preservation

The invention discloses a preparation method of chitosan derivative and its application in food preservation. A preparation method of chitosan derivatives, chitosan derivatives by chitosan powder in the reaction solution containing phenolic compounds and recombinant bacterial laccase in 60 85 DEG C temperature condition 0.5 and 4H; the phenolic compounds from ferulic acid, caffeic acid, chlorogenic acid, gallnut acid, gallic acid, catechin, tannic acid, tea polyphenols in any one. Compared with the chemical method, the preparation method of the bacterial laccase catalyzed synthesis of chitosan derivatives has the advantage of environmental friendliness, and belongs to a green production mode. The recombinant bacterial laccase has good thermal stability and the catalytic reaction liquid can be reused for many times. The chitosan derivative described in the invention has good preservation effect in various kinds of food, such as fruit and vegetable, meat products, dairy products, oil products and so on.

【技术实现步骤摘要】
一种壳聚糖衍生物制备方法及其在食品保鲜中的应用
本专利技术属于食品工业生物
，涉及一种壳聚糖衍生物制备方法及其在食品保鲜中的应用。
技术介绍
壳聚糖(Chitosan，CTS)是甲壳素在浓碱条件下或在脱乙酞酶存在的情况下进行脱乙酰化处理而得到的一种衍生物，它是一种不溶于水、能溶于酸的天然多糖，研究中通常用有机酸(如乙酸)来溶解。壳聚糖安全无毒、生物可降解，同时作为一种天然可再生资源，具有很高的疏水性、机械特性和抑菌性能，在食品保健与包装、农业、生物医药和污水处理等方面有广泛的应用。在壳聚糖的基本结构单元上存在多个活性部位，在C-3和C-6位上均存在活性羟基基团，而C-2位上则存在活性氨基基团(-NH2)，将壳聚糖分散到l0wt％以下的酸溶液中时，C-2位置上的-NH2与H+质子结合，可以形成带正电(NH3+)的阳离子介质电解质，因此，壳聚糖在酸溶液中具有弱正电性，使生成的壳聚糖氨基盐与酸溶液形成透明的粘性胶体溶液。壳聚糖对某些细菌、真菌和酵母具有一定的抑菌活性。壳聚糖可抑制荧光假单胞菌、蜡状芽胞杆菌、念珠菌、乳酸菌、灰霉菌和李斯特菌等多种微生物的生长。壳聚糖虽具有广谱抑菌性，但其抑菌活性仍低于大多数化学合成的抑菌剂，并且中、高分子量的壳聚糖溶解性较差，分子内及分子间形成大量的氢键。此外，壳聚糖分子上因缺少氢原子供体而抗氧化性较差。通过接枝抗氧化强的小分子物质可以改善壳聚糖的抗氧化性和抑菌性。壳聚糖C-3位的仲经基、C-6位的伯经基和C-2位的氨基是活性官能团，尤其是C-2位的氨基活性最高，可以通过在C-2位的氨基接枝小分子物质进行改性。目前，对壳聚糖改性使用化学方法的较多，但用到的化学试剂(如酞氯、醛、环氧化物等)危害性极大，对环境造成严重污染，并且化学改性需要步骤复杂、副产物多、产率低。生物催化法具有独特的优势，其反应条件温和、反应效率高、副产物较少、对环境友好。漆酶(Laccase，EC1.10.3.2，Lac)，是自然界普遍存在的一种含铜金属酶类，可催化各种酚类物质如儿茶素、单宁、黄酮等氧化为醌。大量关于漆酶的研究工作取材于真菌，分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)及半知菌类(Imperfectfungi)等真菌，其中最主要的是担子菌门中的白腐真菌。真菌漆酶最大的问题是其热稳定性差，pH稳定性差不适合于实际的生产加工应用。细菌来源漆酶具有良好热稳定性，在催化反应壳聚糖接枝酚酸物质的过程中与加热物理变性可以起到协同作用，促进共价接枝反应的进行。而目前关于热稳定性的重组细菌漆酶应用于制备壳聚糖衍生物还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种壳聚糖衍生物的制备方法，并应用于食品保鲜。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：一种壳聚糖衍生物的制备方法，壳聚糖衍生物是通过壳聚糖粉末在含有酚酸类化合物和重组细菌漆酶的反应液中，60-85℃温度条件下反应0.5-4h而得；所述的酚酸类物质选自阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、五倍子酸、没食子酸、儿茶素、单宁酸、茶多酚中的任意一种。所述的反应液优选含有如下物质：(a)1-2wt％的壳聚糖粉末；(b)5-20mM的酚酸类化合物；(c)1-3U/100mL的重组细菌漆酶；(d)使用盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、乳酸中任意一种或两种酸调节反应缓冲液的pH至4-7，酸的浓度为50-100mmol/L。所述的壳聚糖粉末包括分子量优选10-400kDa,进一步优选10kDa,50kDa,150kDa,200kDa,300kDa和400kDa的壳聚糖。所述的壳聚糖衍生物的制备方法，优选包括如下步骤：(1)将酚酸类化合物溶解于纯水，酚酸类化合的浓度为5-20mM，优选10mM；(2)用盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、乳酸中的任意一种或两种调节pH至4-7，优选6.5；(3)加入壳聚糖粉末；(4)加入重组细菌漆酶，质量百分浓度为酶活浓度为1-2U/100mL反应液，优选1U/100mL反应液。(5)磁力搅拌器搅拌条件下，搅拌器转速50-150rpm，75-85℃反应0.5h-4h；(6)反应结束后，自然沉降，或离心机离心获得接枝酚酸类化合物的壳聚糖衍生物。步骤(5)磁力搅拌器搅拌条件优选搅拌转速为100rpm，80℃，反应1h。步骤(6)所述的离心条件优选3000-5000rpm离心10-20min；进一步优选4000rpm，15min。所述的壳聚糖衍生物的制备方法，优选还包括(7)将步骤(6)获得的沉淀物经过三次乙醇清洗后，自然晾干得接枝酚酸类化合物得壳聚糖衍生物。本专利技术中所述的重组漆酶优选通过如下方法制备：(1)提取保藏号为CGMCCNo.6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103的基因组DNA，设计上、下游引物，以fmb-103的基因组DNA为模板，PCR扩增漆酶基因；；(2)将上一步纯化的PCR产物经SacI、XhoI双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI酶切位点之间，获得含有fmb-L103基因的表达质粒pET-23a-fmb-L103；(3)将含有fmb-L103表达质粒pET-23a-fmb-L103转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50mlLB液体培养基，70-90rpm30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100mlLB液体培养基,35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导，5小时后离心收集菌体；(4)将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃，10000×g离心10min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTAHisTagKit说明书进行纯化。按照所述的制备方法制备得到的壳聚糖衍生物。本专利技术所述的壳聚糖衍生物在在食品抗菌、抗氧化和/或保鲜中的应用。所述的食品优选自果蔬、肉制品、奶制品或油脂类制品。有益效果：本专利技术针对壳聚糖抗氧化性和抗菌性能力不足的问题，以重组细菌漆酶作为催化剂，催化各种酚酸类化合物共价接枝到壳聚糖分子，制备抗氧化和抗菌性能改良的壳聚糖衍生物。本专利技术中的方法与化学法比，具有环境友好的优势，属于一种绿色生产方式。并且使用的重组细菌漆酶具有良好的热稳定性，催化反应液能多次重复利用，弥补了真菌漆酶在实际生产加工中极易失活的问题。催化制备的壳聚糖衍生物在抗氧化和抗菌性能方面显著提高，对果蔬、肉制品、奶制品、油脂类等食品具有良好的抗菌抗氧化保鲜效果。生物材料保藏信息死亡谷芽孢杆菌fmb-103，分类命名为Bacillusvallismortis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年06月08日，保藏号为CGMCCNo.6198。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述。实施例1：死亡谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)fmb-103漆酶基因的克隆离心收集死亡谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)fmb-103菌体(CGMCCNo.61本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖衍生物是通过壳聚糖粉末在含有酚酸类化合物和重组细菌漆酶的反应液中，60‑85℃温度条件下反应0.5‑4h而得；所述的酚酸类化合物选自阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、五倍子酸、没食子酸、儿茶素、单宁酸、茶多酚中的任意一种。

【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖衍生物是通过壳聚糖粉末在含有酚酸类化合物和重组细菌漆酶的反应液中，60-85℃温度条件下反应0.5-4h而得；所述的酚酸类化合物选自阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、五倍子酸、没食子酸、儿茶素、单宁酸、茶多酚中的任意一种。2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖衍生物的制备方法，其特征是所述的反应液含有如下物质：(a)1-2wt％的壳聚糖粉末；(b)5-20mM的酚酸类化合物；(c)1-3U/100mL的重组细菌漆酶；(d)使用盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、乳酸中任意一种或两种酸调节反应缓冲液的pH至4-7，酸的浓度为50-100mmol/L。3.根据权利要求2所述的壳聚糖衍生物的制备方法，其特征是所述的壳聚糖粉末包括分子量为10-400kDa的壳聚糖.优选10kDa,50kDa,150kDa,200kDa,300kDa或400kDa的壳聚糖。4.根据权利要求2所述的壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将酚酸类化合物溶解于纯水，酚酸类化合的浓度为5-20mM，优选10mM；(2)用盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、乳酸中的任意一种或两...

【专利技术属性】
技术研发人员：张充，步国建，张晓健，孙建娜，
申请(专利权)人：泰兴市东圣生物科技有限公司，南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32