一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法技术

一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法，该方法包括菌丝多糖多肽的物理方法与酶解相结合的高效提取、乙醇沉淀分离、左旋咪唑和高浓度乙醇分别沉淀纯化、复合免疫增强注射剂的配伍制剂等步骤。可与疫苗混合或配合注射剂提高动物免疫，生产效率高，相对生产成本低。本发明专利技术开发的松乳菇菌丝多糖基于其组成单糖较简单，可以进一步分解制备稀有功能性单糖，工艺简单。

Preparation of a drug - eating fungal mycelial polysaccharide polypeptide immunization agent

Preparation method of reinforced agent is a kind of edible and medicinal fungi mycelium polysaccharide peptide and enzyme physical immunity, this method including the mycelia polysaccharide peptide solution extraction, ethanol precipitation separation, combination of levamisole and high concentration ethanol precipitation and purification, respectively enhanced compatibility preparation steps such as injection of immune complexes. It can be mixed with vaccines or combined with injections to improve animal immunity, with high production efficiency and relatively low production cost. The mycelium polysaccharide of Lactobacillus Pleurotus developed by the invention is simple, and can be further decomposed and prepared to prepare rare functional monosaccharides.

【技术实现步骤摘要】
一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法
本专利技术涉及一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法。
技术介绍
食药真菌功能物质：食药真菌中富含蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素及微量元素等营养物质外,还含有大量多糖、多肽、核苷、萜类等活性物质，其中分离和纯化产物,表现出很强的抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗病毒、抗细菌和抗其它寄生虫功能,还有治疗糖尿病、心血管病和高胆固醇症的作用，具有防病、治病和调节人体生理机能的功效。近年来国内外学者们对食用菌中的活性物质的研究十分火爆，尤其对食用菌中的生物活性多糖、活性蛋白多肽的研究越来越多，食用菌作为保健食品进入了人民大众的生活中。随着大型真菌发酵工艺的成熟，对药食真菌活性物质的提取从子实体转向发酵菌丝体。多糖：多糖又称聚多糖(polysaccharidc),由单糖聚合成，聚合度大于10的极性大分子，分子量为数万至数百万，是构成生命活动的4大基本物质之一，是自然界含量最丰富的生物聚合物，几乎存在于所有生物体中。多糖与生命的多种生理功能密切相关，不仅为生物提供骨架结构和能量来源，还参与细胞各种生理过程的调节。许多功能性多糖具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗病毒、抗癌和免疫调节等功能。真菌多糖是重要的一类，系从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出来的，包括酵母多糖、香菇多糖、裂殖多糖、灵芝多糖、黑木耳多糖、灰树花多糖等。多糖与蛋白质一样结构分子复杂，蛋白质由20种氨基酸组成，而多糖由上百种单糖(单糖按碳原子数分为3、4、5、6碳糖，按官能团分为酮糖和醛糖，酮糖和醛糖基于手性碳原子可形成2n个对映体…等)，通过不同的糖苷键(α—1，4；β—1，3；β—1，4；β—1，6；α—1，6等糖苷键)构建成含10个以上单糖(自然界多糖多为80—100个单糖组成)的结构物；其结构有直链型和支链型，进而形成不同的立体结构。因此，多糖种类繁多，性质千差万别。多糖的理化性质分析包括分子量测定和结构分析，前者因多糖分子量不均一性而比较困难，通常所测得的分子量一般只能是一种统计平均值；后者有化学方法(酸水解法、甲基化反应、碱降解法)和物理分析法(红外光谱、核磁共振、质谱、气相色谱、紫外光谱等)。还有，比旋光测定常用作α或β苷键的判断，X射线衍射分析法、激光喇曼光谱法、热谱法等用来分析多糖链的结构。近年来，对天然多糖的分子组分及结构有不少研究，但多糖结构的研究起步比蛋白质研究晚，且测定方法更复杂，难度更大。因此，至今许多重要多糖的组成结构不清，或不同的测定存在差异，如贵红2003年报道的松乳菇子实体多糖为葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖等单糖[12]，但丁祥等2012年的专利报道是甘露糖与木糖以3:1组成[24]，二者差异很大。多糖在自然动植物中以游离或结合(蛋白聚糖和脂多糖)状态存在，大多数多糖呈水溶性，其提取方法大多采用水浸提(冷浸或热浸)或辅助(超声波、微波、酶解、稀酸或稀碱等)水浸提等；但由于多糖的存在形式与自身性质的不同，对同一样品不同方法的提取效果差别极大。通常水+辅助方法提取的提取率比单一水提取的高，而谢红旗2007年报道超声波和微波辅助热水浸提香菇多糖的效果，比单用热水浸提的效果差，提取率和提取纯度均降低。另外，稀酸、稀碱、微波、超声波和酶可提高提取率，但也可降解多糖，影响其活性，陈卫云2011报道超声微波酶解法提取的荔枝多糖(LCP)的抗氧化能力、促进脾淋巴细胞增殖和NK细胞杀伤能力等活性显著高于热水法提取的LCP(P≤0.05)。另外，方法一样，如处理条件不当，亦可影响其活性，何传波等2013报道酶解和微波处理得到的海带多糖样品比常规水浴浸提的样品的抗氧化活性有所提高；但随着酶用量的增加和微波萃取时间的延长,抗氧化活性呈现下降趋势。刘育玲等2010报道：酶解条件和冰乙醇用量对茶多糖的提取效率有较大的影响,获得茶多糖的高提取效率(54.70％)与获得茶多糖的高降糖活性(葡萄糖激酶相对酶活比值达3.97)所需条件不同。关于多糖的分离纯化，植物多糖与蛋白质一样结构复杂，具有一、二、三、四级结构。由于多糖的生物活性与其化学结构有着重要的关系，为了得到单一分子量的纯多糖，选择一种恰当的分离纯化方法非常重要(舒任庚等2011)。多糖分离常用沉淀法(乙醇、丙酮等有机溶剂)沉淀，再用Sevage法去除蛋白；纯化常用色谱法，包括凝胶柱(Sephadex、Sepharase、活性炭等)和子交换柱(DEAE纤维素等)等色谱法，各类色谱介质(填充剂)种类很多，性质不同，处理方法(条件)也不同，应根据多糖的理化性质及分子大小等进行选择适合的色谱柱，并摸索其分离条件(洗脱剂种类及pH值、流速、分离柱的径高比、分离温度等)。这些方法的不足主要是大多只考虑多糖，而对样品中其它功能物质的利用缺乏。其实大活性多糖多为多组分的复合多糖，在分离纯化中最主要的是除蛋白质，目前去除蛋白质的方法最有效的是Sevage法。而该方法需多次用有机溶剂处理，存在工艺复杂和产品及环境污染等问题。多肽(polypeptide)：是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸以不同的组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同的肽类的总称。多肽是源于蛋白质的多功能化合物，但肽的营养和生理功能优于蛋白质(大分子蛋白质)和氨基酸。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，科学发现，几乎所有细胞都受多肽调节，如：细胞分化、神经激素递质调节、免疫调节等均与活性多肽密切相关。特别是一些低肽不仅有比蛋白质更好的消化吸收性能,还具有活化细胞免疫、节植物神经系统、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂、改善心血管功能和抗衰老等生理活性等生理机能。生物活性肽无论是从结构还是从功能来说，生物活性肽都是自然界中存在种类最多，功能最复杂的一类化合物，广泛的存在于细菌、真菌、植物和动物中。目前报道较多的是从植物蛋白或动物蛋白酶解物中提取分离得到的活性肽，如大豆蛋白多肽等；而食用真菌活性肽的研究仅局限于灵芝肽、姬松茸肽、云芝肽、茶树菇肽等。湖南工业研究所[16]从灵芝粉中分离到4个肽，并首次发现灵芝肽具有提高人体耐缺氧能力的活性；1984年上海师范大学杨庆尧教授首次从培养的云芝深层菌丝体中提取出云芝糖多肽(polysaccharopeptide，PSP)，是云芝的主要活性成分，具有很强的免疫调节作用，为抗肿瘤的免疫调节辅助药物。2004年焦迎春[22]等用两次葡聚糖凝胶色谱法从姬松茸菌丝体中提取到肽类物质,分析测定表明,姬松茸菌丝体活性肽是一种具有高F值(22.5)的寡肽,其分子量在1500～30000U之间。近年来，国外越来越多的学者开始研究食用菌中的活性肽的分离提取与纯化方法，1997年，何慧[17]等人将发酵灵芝粉的水和醇提取物上离子交换树脂柱,依次用酸性、中性、碱性淋洗液洗脱分组,得酸溶性、水溶性和碱溶性的肽类化合物；其中碱溶性的肽对羟基自由基的抑制作用最强(高达81％)。2001年，孙慧[18]等采用Cu—SephadexG—25柱层析法和超滤膜过滤法，将灵芝的水提取物中的小肽与游离氨基酸有效地分离。2008年，宋万杰[21]首次采用超高压提取技术提取云芝菌丝体中活性肽，得率为3.23％，他还将云芝菌丝体以中性、酸性和碱性三种蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)菌丝发酵物的制备：以液态深层发酵方法培养松乳菇、金针菇、香菇、猴头菇、松茸等食药真菌菌丝，25‑30℃，100‑180r/min培养2‑4d，制备食药真菌菌丝发酵物，包括菌丝与发酵液。(2)多糖多肽提取：菌丝发酵物→研磨或高压均浆破碎菌丝→加0.05‑0.2％(w/v)的复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1.5：2‑3)进行第一次酶解(PH5,50℃,2‑3h),80‑90℃灭活10‑20min；用中性蛋白酶(木瓜蛋白酶等)第二次酶解(pH7.0，50℃，2‑3h，用酶量32万U/100ml),→微波(120S～180S)或超声波(400W，50‑60℃,40‑60min)处理→过滤→4000‑5000rpm离心10‑20min,得多糖与多肽粗提取液；(3)多糖多肽分离：粗提液减压浓缩，加乙醇至乙醇体积百分比浓度为70—75％，搅匀，静止沉淀过夜，使提取液中的多糖和多肽初步分离，得作为沉淀物的粗多糖和作为上清液的粗多肽；(4)粗多糖多肽纯化：1)粗多糖的纯化：将乙醇沉淀物水溶解，4号垂溶漏斗过滤后取滤液；加盐酸左旋咪唑使其体积百分比浓度为0.1—0.5％，煮沸15min，静置过夜，使蛋白与盐酸左旋咪唑结合沉淀，取上清液，280nm处测定无蛋白，离心；将上清液用碱调PH至7—8，按体积加入2—8％过氧化氢(w/v),于50—70℃脱色2—3h；加石油醚和氯仿分次萃取脱脂、脱色和残存左旋咪唑；超滤除菌和大分子物质；于60—80℃减压浓缩或纳滤膜过滤浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥，或超滤后直接喷雾干燥，制得无菌纯化真菌多糖。2)粗多肽的纯化：取乙醇沉淀的上清液低温减压回收乙醇，再用体积百分比浓度为80％、85％、90％、95％的乙醇依次沉淀，至无沉淀(大分子蛋白、多糖等)后，于50—70℃减压回收乙醇；如有脂肪存在(香草醛比色法或尼罗红染色法检测)，再经乙醇、丙酮、乙醚分步脱脂；配制成水溶液，加0.5‑1.5％活性炭脱色(搅拌2h，静置10min)，超滤除菌和大分子物质；滤液经纳滤膜过滤浓缩或50—70℃减压浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥；制得无菌纯化真菌多肽。(5)复合免疫增强剂配伍制剂：1)粉针制剂：将所得的无菌纯化真菌多糖、真菌多肽按质量比(2—5)：(1—5)配伍，无菌分装，制得药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强粉针剂。也可按质量百分比加1‑5％盐酸左旋咪唑(注射用)制备左旋咪唑多糖多肽粉针。临用时用注射用水或生理盐水配制。2)水针制剂：将纯化多糖多肽按质量比(2—5)：(1—5)取样，配制成10‑30％(w/v)水溶液，超滤膜过滤，在无菌条件下分装于经高压消毒的药瓶内，巴氏消毒老化一体机中进行巴氏消毒，制备多糖多肽注射液。或将多糖多肽溶液中再加入0.1‑1.0％(W/V)盐酸左旋咪唑，并用盐酸(作稳定剂)下调PH值1‑2(至PH4‑6.5)，溶解混匀，过滤，分装，消毒，制备左旋咪唑多糖多肽注射液。...

【技术特征摘要】
1.一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)菌丝发酵物的制备：以液态深层发酵方法培养松乳菇、金针菇、香菇、猴头菇、松茸等食药真菌菌丝，25-30℃，100-180r/min培养2-4d，制备食药真菌菌丝发酵物，包括菌丝与发酵液。(2)多糖多肽提取：菌丝发酵物→研磨或高压均浆破碎菌丝→加0.05-0.2％(w/v)的复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1.5：2-3)进行第一次酶解(PH5,50℃,2-3h),80-90℃灭活10-20min；用中性蛋白酶(木瓜蛋白酶等)第二次酶解(pH7.0，50℃，2-3h，用酶量32万U/100ml),→微波(120S～180S)或超声波(400W，50-60℃,40-60min)处理→过滤→4000-5000rpm离心10-20min,得多糖与多肽粗提取液；(3)多糖多肽分离：粗提液减压浓缩，加乙醇至乙醇体积百分比浓度为70—75％，搅匀，静止沉淀过夜，使提取液中的多糖和多肽初步分离，得作为沉淀物的粗多糖和作为上清液的粗多肽；(4)粗多糖多肽纯化：1)粗多糖的纯化：将乙醇沉淀物水溶解，4号垂溶漏斗过滤后取滤液；加盐酸左旋咪唑使其体积百分比浓度为0.1—0.5％，煮沸15min，静置过夜，使蛋白与盐酸左旋咪唑结合沉淀，取上清液，280nm处测定无蛋白，离心；将上清液用碱调PH至7—8，按体积加入2—8％过氧化氢(w/v),于50—70℃脱色2—3h；加石油醚和氯仿分次萃取脱脂、脱色和残存左旋咪唑；超滤除菌和大分子物...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘莹莹，肖毅，肖兵南，蒋小文，
申请(专利权)人：湖南民康生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43