一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法技术

本发明专利技术公开了一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法，丛枝菌根真菌孢子的筛选，丛枝菌根真菌孢子的消毒，消过毒的孢子在显微镜下用无菌的枪头吸取转移到置于培养皿中的培养基上，每个培养皿接种50个孢子，置暗箱中培养，26℃条件下，培养20d完成培养过程。本发明专利技术的有益之处是采用RiT-DNA转基因胡萝卜根的根分泌液(50ml/L)，外加葡萄糖和适当的氮源促进Glomus intraradices孢子萌发和菌丝生长。本方法操作简便，材料廉价，环境友好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于真菌萌发及菌丝衍生促进剂
，涉及。
技术介绍
丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是在陆地上栖息的最普遍的、具有与最广泛植物种类存在地下共生关系的真菌。在土壤中和一个宿主植物形成共生关系之前，丛枝菌根真菌经历一个前共生阶段，包含孢子萌发、菌丝生长和形成分枝；当存在寄主根时，随着附着泡的形成，再入侵到根内并在细胞间延伸，形成丛枝状结构，然后外生菌丝生长，最后形成孢子。AM真菌的孢子是非常大的，并且包括许多细胞核，储存了大量的脂肪和糖类。储存如此大容量的基因信息和能量是该物种的选择优势，但是很清楚AM真菌的孢子不含有支持持续生长和完成生命循环的生物学因素，除非它们成为与寄主共生的一部分。这是因为在前共生阶段缺乏一种或者多种营养元素，包括缺乏合成脂肪酸的能力。于是，AM真菌必须依赖由萌发孢子或根外菌丝生成的萌发管侵染到植物根中，从而完成AM真菌的生命循环过程。显然，AM真菌的孢子可以在不含任何矿质营养物质的水中萌发，AM真菌的孢子在萌发早期的一些生化反应，例如在Glomus mosseae的孢子中存在萘酹磷酸酯酶,这可能涉及激活孢子萌发且在生长菌丝中有细胞溶解的作用；在孢子萌发过程中也发现存在TCA循环、EMP糖降解途径和磷酸己糖支路途径。Glomus caledonius孢子中发生脂肪代谢、RNA和蛋白质的生物合成。此外，发现含硫的氨基酸可能促进萌发孢子菌丝的生长。 尽管孢子内储存着大量的C源，许多文献报道AM真菌孢子可以吸收乙酸、葡萄糖、果糖和CO2作为C源。AM真菌孢子储存的C源也被分解并且用来合成氨基酸(arginine，Arg和glutamine, Gln)。显然，AM孢子中氨基酸的生物合成需要内部存储的N或外源N。N是植物组织中最丰富的矿物质元素，在植物生长所需要的营养物质中，氮通常是受限制的元素。研究表明AM真菌菌丝从土壤中吸收不同形式的N并且运转到植物寄主中去。然而，在不同的土壤条件中AM真菌孢子萌发时也可以吸收和代谢利用不同形式N素。此外，在AM真菌前共生阶段时许多外界条件和因素(根际、根分泌液、黄酮类、土壤微生物和悬浮培养植物细胞)都能影响萌发率和促进无寄主菌丝的生长繁殖。例如，根分泌液可以增加AM真菌菌丝长度和菌丝分支。为了促进AM真菌孢子萌发及菌丝生长，在培养介质中加入根分泌液，同时也添加无机氮源和葡萄糖。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，本专利技术的有益之处是采用RiT-DNA转基因胡萝卜根的根分泌液(50ml/L)，外加葡萄糖和适当的氮源促进Glomus intraradices孢子萌发和菌丝生长。本方法操作简便,材料廉价,环境友好。专利技术所采用的技术方案是按照以下步骤进行:步骤1:丛枝菌根真菌孢子的筛选，称取含丛枝菌根真菌的沙子菌剂倒入杯中加水搅拌、用400目孔径的双层筛网筛洗，直到搪瓷杯中水清澈为止，随后自来水不断清洗筛网，收集下层400目筛网的孢子，筛出物放入培养皿中，用移液枪吸取孢子于干净的锥形瓶中备用；步骤2:丛枝菌根真菌孢子的消毒，将上一步锥形瓶中收集的孢子倒入无菌的纱网中，用无菌水在超净台上先冲数遍，然后放于漏斗中，倒入配好消毒液冲洗1-2遍，用无菌皮塞塞住漏斗的低部，继续添加消毒液，震荡之后，去掉皮塞，用无菌水冲洗；步骤3:将消过毒的孢子在显微镜下用无菌的枪头吸取转移到置于培养皿中的培养基上，每个培养皿接种50个孢子，置暗箱中培养，26°C条件下，培养20d完成培养过程。进一步,步骤I中丛枝菌根真菌为根内球囊霉菌。进一步，步骤2中的消毒液是:氯胺T+200mg/L链霉素+100mg/L庆大霉素消毒液+1%滴TWeen20处理15min，所述的孢子的消毒液，均采用无菌过滤膜加注，存储应4°C冷藏。进一步，步骤3中所述培养基为:NaN03、NH4Cl、NH4N03、Urea分别按4mmol/L分别加入到葡萄糖、根分泌液或琼脂中。进一步， 培养基为葡萄糖5g/L和尿素2mmol/L组成，以及50ml/L根分泌液和尿素2mmol/L组成对孢子萌发率最好；或培养基为葡萄糖5g/L和NH4N034mmol/L组成，以及50ml/L根分泌液和NH4N034mmol/L组成对菌丝长度最好。【附图说明】图1是本专利技术葡萄糖和不同氮源对孢子萌发的影响示意图；图2是本专利技术葡萄糖和不同氮源对菌丝生长的影响示意图；图3是本专利技术根分泌液和不同氮源对孢子萌发的影响示意图；图4是本专利技术根分泌液和不同氮源对菌丝生长的影响示意图。【具体实施方式】下面结合附图和【具体实施方式】对本专利技术进行详细说明。本专利技术对照现有技术的有益效果是:材料设备简单，容易实施，成本小，环境友好。本技术促进丛枝菌根真菌孢子快速萌发及菌丝生长快速衍生，原有的孢子萌发的培养基，传统方法中用的是水琼脂，但是这不利于孢子在后期生长时因营养物质缺乏而影响其进一步和植物体共生，本实验提供了一种不但使孢子萌发时间周期短缩短，而且能提高萌发率和促进菌丝长度的增加的有利条件，孢子的高萌发率和较快菌丝生长速度保证了作为生物肥料在农业上的高效发挥。本专利技术采用的技术方案步骤:步骤1:丛枝菌根真菌孢子的筛选及提纯:丛枝菌根真菌孢子可以是AM真菌孢子即根内球囊霉菌，称取IOgAM真菌(G.1ntraradices)的沙子菌剂倒入杯中，不断的加水搅拌、用400目孔径的双层筛网筛洗，直到搪瓷杯中水清澈为止，随后自来水不断清洗筛网，收集下层400目筛网的孢子，筛出物放入培养皿中，显微镜下，用移液枪吸取孢子于干净的锥形瓶中备用。步骤2:AM真菌孢子的消毒:将上一步锥形瓶中收集的孢子倒入无菌的纱网中，用无菌水在超净台上先冲数遍，然后放于漏斗中，倒入配好消毒液冲洗1-2遍，然后，用无菌皮塞塞住漏斗的低端，在继续添加消毒液，震荡15min之后，去掉皮塞，用无菌水冲洗10遍，所述的孢子的消毒液，均采用无菌过滤膜加注，存储应4°C冷藏。步骤3:孢子接种和培养:把消毒过的孢子放置到培养皿中，再将此培养皿放到显微镜下用无菌的枪头吸取孢子，每个培养皿接种50个孢子，置暗箱中培养，26°C，培养20d(天).所述培养基的配置，均按实验设计中所配置。培养基的配制:培养基为把NaNO3、NH4Cl、NH4NO3、Urea (尿素)分别按4mmol/L加入到葡萄糖、根分泌液中，相应的实验对照组为对照1:葡萄糖(5g/L)+0.8%琼脂，对照2:根分泌液(50ml/0+0.8%琼脂邛册.5，1201:灭菌2511^11。如表1。表1培养基配制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1：丛枝菌根真菌孢子的筛选，称取含丛枝菌根真菌的沙子菌剂倒入杯中加水搅拌、用400目孔径的双层筛网筛洗，直到搪瓷杯中水清澈为止，随后自来水不断清洗筛网，收集下层400目筛网的孢子，筛出物放入培养皿中，用移液枪吸取孢子于干净的锥形瓶中备用；步骤2：丛枝菌根真菌孢子的消毒，将上一步锥形瓶中收集的孢子倒入无菌的纱网中，用无菌水在超净台上先冲数遍，然后放于漏斗中，倒入配好消毒液冲洗1‑2遍，用无菌皮塞塞住漏斗的低部，继续添加消毒液，震荡之后，去掉皮塞，用无菌水冲洗；步骤3：将消过毒的孢子在显微镜下用无菌的枪头吸取转移到置于培养皿中的培养基上，每个培养皿接种50个孢子，置暗箱中培养，26℃条件下，培养20d完成培养过程。

【技术特征摘要】
1.一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法，其特征在于按照以下步骤进行: 步骤1:丛枝菌根真菌孢子的筛选，称取含丛枝菌根真菌的沙子菌剂倒入杯中加水搅拌、用400目孔径的双层筛网筛洗，直到搪瓷杯中水清澈为止，随后自来水不断清洗筛网，收集下层400目筛网的孢子，筛出物放入培养皿中，用移液枪吸取孢子于干净的锥形瓶中备用; 步骤2:丛枝菌根真菌孢子的消毒，将上一步锥形瓶中收集的孢子倒入无菌的纱网中，用无菌水在超净台上先冲数遍，然后放于漏斗中，倒入配好消毒液冲洗1-2遍，用无菌皮塞塞住漏斗的低部，继续添加消毒液，震荡之后，去掉皮塞，用无菌水冲洗； 步骤3:将消过毒的孢子在显微镜下用无菌的枪头吸取转移到置于培养皿中的培养基上，每个培养皿接种50个孢子，置暗箱中培养，26°C条件下，培养20d完成培养过程。2.按照权利要求1所述一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发及菌丝衍生方法，其特征在于:所述步骤I中丛枝菌根真菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：金海如，赵腊梅，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33