抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法技术

本发明专利技术公开了一种抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法，是通过在茂源链霉菌IPIO中，利用CRISPRi技术弱化茂源链霉菌IPIO中非必需高丰度蛋白编码基因的转录水平，得到高产谷氨酰胺转氨酶的突变株。本发明专利技术通过降低高丰度蛋白编码基因SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989和SMDS_6427的转录水平，抑制了这些蛋白的合成，减轻TG酶合成过程中的氨基酸前体竞争压力，以此来提高谷氨酰胺转氨酶的发酵水平。本发明专利技术所得的工程菌株的谷氨酰胺转氨酶发酵产量在实验室摇瓶水平下较对照菌株分别提高37％、35％、46％和32％。通过本发明专利技术可显著提高谷氨酰胺转氨酶的发酵产量，同时大幅度降低发酵成本。降低发酵成本。降低发酵成本。

【技术实现步骤摘要】
抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种抑制非必需高丰度蛋白表达以提高TG酶发酵水平的方法，具体说是一种利用CRISPRi技术降低SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989 和SMDS_6427的转录水平，抑制上述4种高丰度非必需蛋白的表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法。

技术介绍

[0002]谷氨酰胺转氨酶(TG酶)是由茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ
‑
酰胺基和赖氨酸的ε
‑
氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε
‑
(γ
‑
谷酰胺)
‑
赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质，被广泛应用于食品行业蛋白制品食用添加剂、交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物、提高羊毛纺织品的强度等，市场需求量逐年上升，然而目前该酶产量仍然较低，亟待进一步提升。本专利技术发现，在茂源链霉菌生产TG酶的过程中，胞内胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TG酶高产菌株，其特征在于，所述菌株的非必需高丰度蛋白编码基因转录被抑制。2.如权利要求1所述的TG酶高产菌株，其特征在于，在茂源链霉菌IPIO中通过CRISPRi技术分别降低了基因SMDS_5177、SMDS_758、SMDS_5989、SMDS_6427的转录水平。3.一种用于降低蛋白编码基因转录水平的整合型质粒载体，其特征在于，所述载体分别抑制了茂源链霉菌IPIO的谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶抑制蛋白编码基因SMDS_5177、短杆菌肽合酶C亚基蛋白编码基因SMDS_758、苦霉素合酶模块3和4蛋白编码基因SMDS_5989、促自溶诱导蛋白编码基因SMDS_6427的转录水平，含有靶向以上4个基因启动子区域的gRNA，通过降低基因转录水平抑制蛋白表达。4.根据权利要求3所述的整合型质粒载体，其特征在于，所述基因SMDS_5177的序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的gRNA
SMDS_5177
的序列如SEQ ID NO.2所示；所述SMDS_758的序列如SEQ ID NO.3所示，其对应的gRNA
SMDS_5989
的序列如SEQ ID NO.4所示；所述基因SMDS_5989的序列如SEQ ID NO.5所示，其对应的gRNA
SMDS_5989
的序列如SEQ ID NO.6所示；所述基因SMDS_6427的序列如SEQ ID NO.7所示，其对应的gRNA
SMDS_6427
的序列如SEQ ID NO.8所示。5.一种根据权利要求3或4所述的整合型质粒载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在CRISPy
‑
web网站上设计特异性靶向SMDS_5177启动子区域的gRNA，通过PCR扩增得到含sgRNA
SMDS_5177
基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET
‑
dCas9
‑
actII4
‑
NT
‑
S1中的SpeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ2103；或，在CRISPy
‑
web网站上设计特异性靶向SMDS_758启动子区域的gRNA，通过PCR扩增得到含sgRNA
SMDS_758
基因序列的PCR片段，通过Gibson连接的方法连入整合型质粒pSET
‑
dCas9
‑
actII4
‑
NT
‑
S1中的SpeI/EcoRI位点，获得整合型质粒载体pLQ2104；或，在CRISPy
‑
web网站上设计特异性靶向SMDS_5989启动子区域的gRNA，通过PCR扩增得到含sgRNA
SMDS_5989
基因序...

【专利技术属性】
技术研发人员：白林泉，吴邦昊，王丹，步建国，
申请(专利权)人：泰兴市东圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：