一株双厌氧启动子诱导产高光学纯D-乳酸的工程菌及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一株双厌氧启动子诱导产高光学纯D

【技术实现步骤摘要】
一株双厌氧启动子诱导产高光学纯D
‑
乳酸的工程菌及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及微生物学、生物化学和发酵工程
，特别涉及一株产高光学纯度D
‑
乳酸的工程菌及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]乳酸作为在食品，医药，化工，化妆品等行业的重要原料，具有巨大的生产经济价值。据报道，2016年全球乳酸总产量达到122万吨，并且每年以16.2％的比例增长(Xuejiao Tian,Hao Chen,Hao Liu,Jihong Chen,Recent advances in lactic acid production by lactic acid bacteria,Appl Biochem Biotechnol,2021,193(12):4151
‑
4171)。D
‑
乳酸是一种农药合成的手性中间体，也是合成高耐热性聚乳酸材料的前体，因此其生产和应用受到广泛关注。有研究证明，D
‑
乳酸的光学纯度是决定合成高耐热性聚乳酸(PLA)和手性农药的关键因素。
[0003]微生物发酵法由于原料来源广泛、生产成本低、光学纯度高及安全性高等优点已成为国内外生产D
‑
乳酸的主要方法。D
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乳酸工程菌和生产菌已有不少，主要集中在乳酸菌、酵母菌和大肠杆菌等。现有技术中的方法制备得到的光学纯D
‑
乳酸的光学纯度有待提高。生产D
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乳酸不仅要求其产量，也要求光学纯度一般不低于99.5％，且越高越好。
[0004]因此，为了提高D
‑
乳酸的光学纯度，有必要提供开发一种双厌氧启动子诱导产高光学纯D
‑
乳酸的工程菌及发酵生产高光学纯度D
‑
乳酸的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一株双厌氧启动子诱导产高光学纯D
‑
乳酸的工程菌及其制备方法与应用，该菌株在无氧条件下将L
‑
乳酸转变为丙酮酸的能力高，从而在发酵过程中能消除原料中的L
‑
乳酸，保证每批次发酵生产高光学纯度的D
‑
乳酸。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供了一株双厌氧启动子诱导产高光学纯D
‑
乳酸的工程菌，所述双厌氧启动子诱导产高光学纯D
‑
乳酸的工程菌为Escherichia coli HBUT
‑
D
‑
DNL，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022448。
[0007]在本专利技术的第二方面，提供了所述的工程菌在发酵产高光学纯度D
‑
乳酸中的应用。
[0008]在本专利技术的第三方面，提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包括：
[0009]将所述的双厌氧启动子诱导产高光学纯D
‑
乳酸的工程菌进行发酵获得的发酵液；
[0010]或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。
[0011]在本专利技术的第四方面，提供了所述工程菌的制备方法，所述方法包括：
[0012]以野生型E.coli W的基因组为模板，以SEQ ID NO.3
‑
SEQ ID NO.4所示的引物对进行扩增，获得片段1；
[0013]以野生型E.coli W的基因组为模板，以SEQ ID NO.5
‑
SEQ ID NO.6所示的引物对
进行扩增，获得片段2；
[0014]将所述片段1和所述片段2为模板，以SEQ ID NO.7
‑
SEQ ID NO.8所示的引物对进行扩增，获得片段3；将所述片段3进行TA克隆并筛选阳性克隆，获得质粒pJH
‑
nlldD；
[0015]以所述质粒pJH
‑
nlldD为模板，以SEQ ID NO.9
‑
SEQ ID NO.10所示的引物对进行扩增，并通过切胶回收纯化，获得片段4；
[0016]使用限制性内切酶Hind III对质粒pAGI02进行酶切，并通过切胶回收纯化，获得带有pflBp6的线性化质粒片段；
[0017]将所述片段4与所述带有pflBp6的线性化质粒片段进行无缝克隆，得到双厌氧启动子pflBp6和nirBp调控lldD基因的质粒pJH
‑
pnlldD；
[0018]将所述质粒pJH
‑
pnlldD化转入菌株E.coli HBUT
‑
D15，获得所述工程菌。
[0019]在本专利技术的第五方面，提供了采用所述的工程菌发酵高产光学纯D
‑
乳酸的方法，所述方法包括：
[0020]将所述的双厌氧启动子诱导产高光学纯D
‑
乳酸的工程菌接种于种子培养基中进行种子培养，获得活化菌液；
[0021]将所述活化菌液接种于发酵培养基中进行发酵培养，获得光学纯D
‑
乳酸。
[0022]进一步地，所述种子培养基的配方为：添加4wt％葡萄糖的LB培养基；所述种子培养的条件为温度37
±
0.5℃，转速200
±
20r/min。
[0023]进一步地，所述发酵培养基的配方为：1/5LB培养基，12wt％葡萄糖；所述发酵培养的条件为温度37
±
0.5℃，200
±
20r/min，且所述发酵培养采用厌氧发酵：即添加23wt％氢氧化钙。
[0024]进一步地，所述活化菌液的OD
600
至1
‑
1.5时接种于发酵培养基中进行发酵培养。
[0025]进一步地，所述发酵培养中采用10％的接种量。
[0026]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0027]1、本专利技术通过双启动子稳定增强L
‑
乳酸脱氢酶在厌氧条件下的表达，其效果明显优于单厌氧启动子的效果。通过酶活检测发现，单厌氧启动子对L
‑
乳酸脱氢酶的单位酶活提高到4.2倍，而双厌氧启动子提高到6.29倍。
[0028]2、本专利技术采用的双启动子表达系统是自诱导型表达系统，不需要添加任何诱导剂，不需要增加额外成本；诱导条件仅为厌氧，与厌氧发酵的过程相适宜。
[0029]3、本专利技术应用于D
‑
乳酸发酵生产时，在全程厌氧发酵条件下，能有效消除发酵罐中的L
‑
乳酸，使目的产物D
‑
乳酸的光学纯度显著提高。工程菌E.coli HBUT
‑
D
‑
DNL在23h内可发酵完成，发酵液中含D
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乳酸104
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105g/L，糖酸转化率达95％以上。在添加1g/L的L
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株双厌氧启动子诱导产高光学纯D
‑
乳酸的工程菌，其特征在于，所述双厌氧启动子诱导产高光学纯D
‑
乳酸的工程菌为Escherichia coli HBUT
‑
D
‑
DNL，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022448。2.一种权利要求1所述的工程菌在发酵高产光学纯D
‑
乳酸中的应用。3.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包括：将如权利要求1所述的双厌氧启动子诱导产高光学纯D
‑
乳酸的工程菌进行发酵获得的发酵液；或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。4.一种权利要求1所述的工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括：以野生型E.coli W的基因组为模板，以SEQ ID NO.3
‑
SEQ ID NO.4所示的引物对进行扩增，获得片段1；以野生型E.coli W的基因组为模板，以SEQ ID NO.5
‑
SEQ ID NO.6所示的引物对进行扩增，获得片段2；将所述片段1和所述片段2为模板，以SEQ ID NO.7
‑
SEQ ID NO.8所示的引物对进行扩增，获得片段3；将所述片段3进行TA克隆并筛选阳性克隆，获得质粒pJH
‑
nlldD；以所述质粒pJH
‑
nlldD为模板，以SEQ ID NO.9
‑
SEQ ID NO.10所示的引物对进行扩增，并通过切胶回收纯化，获得片段4；使用限制性内切酶Hind III对质粒pAGI02进行酶切，并通...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金华，赵筱，王永泽，王周，刘宗求，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：