一种减毒单增李斯特菌的构建策略及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种减毒单增李斯特菌的构建策略及应用，所述李斯特菌是以单増李斯特菌野生株为背景，缺失hly基因，第211

【技术实现步骤摘要】
一种减毒单增李斯特菌的构建策略及应用


[0001]本专利技术涉及单核细胞增多性李斯特菌，特别涉及一种减毒单增李斯特菌的构建策略及应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]单核细胞增多性李斯特菌简称单增李斯特菌，是一种人畜共患的食源性胞内寄生病原菌。李斯特菌有着极强的生存能力且广泛分布于各种环境中，能够在许多不同的环境中持续生存，极易感染免疫力低下的人群，造成细菌性败血症、胃肠炎、脑膜炎以及流产等李斯特菌病。
[0003]近年来，科研界通过对李斯特菌的研究发现，其可作为一种有前景的疫苗载体，呈递肿瘤相关抗原，并且在人乳头瘤病毒，前列腺癌，黑色素瘤，转移性乳腺癌等方面都有着不错的成效。减毒活载体疫苗的特点是能引起较强的免疫反应，由于单増李斯特菌能在巨噬细胞内增殖，其能够更好的递呈抗原，除此之外，已知单増李斯特菌LLO能够增强抗原的特异性免疫反应，但是传统的减毒策略主要是毒力基因的缺失、质粒回补等，存在对机体安全性不够、免疫原性低、抗原呈递效率不高等局限性。因此，本专利技术的减毒策略以及获得的减毒活载体疫苗能有效地解决传统疫苗面临的技术缺陷。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种减毒单增李斯特菌的构建策略及应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种减毒单增李斯特菌的构建策略，所述李斯特菌是以单増李斯特菌野生株(WT)为背景，缺失hly基因(编码溶血素LLO蛋白)第211
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215位氨基酸(AYSES)而得，最终所得减毒株命名为LAPAD1115，其保藏编号为CGMCC NO：24070，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0006]本专利技术还提供了一种减毒菌株，含有前述的减毒单核细胞增多性李斯特菌。
[0007]本专利技术还提供了所述减毒单核细胞增多性李斯特菌毒力致弱，可作为活疫苗载体。
[0008]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述减毒单增李斯特菌制备方法包括以下步骤：
[0009](1)构建重组质粒pSL2878；
[0010](2)制备WT感受态细胞；
[0011](3)利用所述步骤(1)制备的重组质粒对所述步骤(2)制备的感受态细胞进行电转化；
[0012](4)WT与重组质粒同源杂交培养、筛选验证。
[0013]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤(1)具体包括：
[0014]以单核细胞增多性李斯特菌WT的hly基因为模板，使用Snapgene软件选取上游同
源臂、下游同源臂，设计引物扩增上、下游同源臂，条带大小分别为533bp和423bp，作为片段A和片段B，其中上游同源臂为hly基因上第33
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210位氨基酸，下游同源臂为hly基因上第216
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348位氨基酸。
[0015]通过重叠PCR技术(SOE
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PCR)将两个片段连在一起，获得A
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B目的片段。
[0016]以BamH I和Pst I为酶切位点，经酶切、酶连至穿梭质粒pKSV7，获得重组质粒pSL2878。
[0017]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤(2)具体包括：
[0018]将WT接种于新鲜无菌的100mLBHI液体培养基中，37℃振荡培养至OD600nm值约为0.18；加入终浓度为20μg/mL青霉素G，37℃振荡培养2h；离心后收集菌体，加入适量洗涤缓冲液，所述缓冲液含1mM HEPES和0.5M蔗糖，洗涤两次，离心弃上清，向沉淀中加入1mL的洗涤缓冲液重悬菌体，分装，置于
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80℃冰箱备用。
[0019]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤(3)具体包括：
[0020]将步骤(1)所得重组质粒电转入步骤(2)所得单増李斯特菌感受态细胞中，加入预热的1mL 2
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BHI和1M蔗糖等体积混合的混合液，充分混匀，置30℃恒温培养箱2
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3h，将转化液均匀涂布于氯霉素抗性的BHI固体培养基中，置37℃培养。
[0021]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤(4)具体包括：
[0022]挑取步骤(3)中获得的单菌落，在无菌的BHI液体培养基扩大培养，进行PCR验证，将阳性菌株置于42℃进行同源重组以及30℃连续传代丢失质粒，最后进行PCR筛选和基因测序验证，得到重组减毒单増李斯特菌；将测序正确的菌液和60％甘油体积比1:1混合，置
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80℃冰箱保存。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0024]1、本专利技术一种减毒单增李斯特菌的构建策略及应用，以单増李斯特菌野生株为背景，利用同源重组技术、基础分子克隆试验操作和生物信息学等手段构建李斯特菌hly基因缺失第211
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215位氨基酸的菌株，减毒株内不含抗性质粒符合生物安全要求，更适合用于临床，减毒株在李斯特菌基因组原位上进行缺失，可消除在免疫过程中质粒丢失的情况，减毒株更加稳定，在此基础上，当携带外源基因时，也能够更稳定的表达。
[0025]2、本专利技术一种减毒单增李斯特菌的构建策略及应用，试验表明，LAPAD1115相较于野生株在小鼠肝脏和脾脏中的定殖能力显著降低，并且在小鼠存活试验中我们发现LAPAD1115的致死率明显下降，本专利技术的单増李斯特菌的减毒株可用于活疫苗治疗载体或免疫佐剂，将hly基因第211
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215位缺失使该细菌毒力大大降低(达到安全级别)，但仍保留了较为完整的免疫原性，由于是在李斯特菌基因组上进行缺失修饰，菌内不含抗性质粒，符合生物安全，同时不会由于质粒的丢失而影响李斯特菌自身的生长。
附图说明
[0026]图1为本专利技术构建的单増李斯特菌同源重组质粒(pSL2878)图谱，包含上下游同源臂533bp和423bp的重组片段；还包含氯霉素抗性基因cat；
[0027]图2为WT与该减毒株感染ICR小鼠后的小鼠存活曲线；
[0028]图3为WT与该减毒株在ICR小鼠肝脾的细菌载量比。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]请参阅图1
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3，本专利技术实施例提供上述减毒单増李斯特菌的制备方法，包括以下步骤：
[0031](1)构建重组质粒pSL2878；
[0032](2)制备WT感受态细胞；
[0033](3)利用所述步骤(1)制备的重组质粒对所述步骤(2)制备的感受态细胞进行电转化；
[0034](4)WT与重组质粒同源杂交培养、筛选验证。
[0035本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种减毒单增李斯特菌的构建策略，其特征在于，所述李斯特菌是以单増李斯特菌野生株(WT)为背景，缺失hly基因(编码溶血素LLO蛋白)第211
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215位氨基酸(AYSES)而得，最终所得减毒株命名为LAPAD1115，其保藏编号为CGMCC NO：24070，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.一种减毒菌株，所述减毒菌株基于上述权利要求1所述的一种减毒单增李斯特菌的构建策略，其特征在于，所述减毒菌株含有权利要求1所述的减毒单核细胞增多性李斯特菌。3.根据权利要求1所述的一种减毒单增李斯特菌的构建策略，所述减毒单核细胞增多性李斯特菌毒力致弱，可作为活疫苗载体。4.根据权利要求1所述的一种减毒单核细胞增多性李斯特菌的构建策略，其特征在于，所述减毒单增李斯特菌制备方法包括以下步骤：(1)构建重组质粒pSL2878；(2)制备WT感受态细胞；(3)利用所述步骤(1)制备的重组质粒对所述步骤(2)制备的感受态细胞进行电转化；(4)WT与重组质粒同源杂交培养、筛选验证。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：以单核细胞增多性李斯特菌WT的hly基因为模板，使用Snapgene软件选取上游同源臂、下游同源臂，设计引物扩增上、下游同源臂，条带大小分别为533bp和423bp，作为片段A和片段B，其中上游同源臂为hly基因上第33
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210位氨基酸，下游同源臂为hly基因上第216
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348位氨基酸。通过重叠PCR技术(SOE...

【专利技术属性】
技术研发人员：程昌勇，宋厚辉，孙静，夏菁，韩月，徐加利，陈绵绵，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：