一种全细胞催化生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸的方法技术

本发明专利技术提供一种用于全细胞催化生产2

【技术实现步骤摘要】
Richard J Giannone, Adam M Guss, Robert L Hettich, Lindsay D Eltis, Christopher W Johnson, Gregg T Beckham. Metabolism of syringyl lignin
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derived compounds in Pseudomonas putida enables convergent production of 2
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pyrone
‑
4,6
‑
dicarboxylic acid. Metabolic Engineering. 2021, 65:111
–
122.）等等。Otsuka等利用共表达鞘氨醇单胞菌Sphingomonaspaucimobilis SYK
‑
6来源的原儿茶酸
‑
4,5
‑
二氧化酶复合体LigAB和4
‑
羧基
‑2‑
羟基粘康酸
‑6‑
半醛脱氢酶LigC的基因工程恶臭假单胞菌作为全细胞催化剂，可以将原儿茶酸催化为2
‑
吡喃酮
‑
4,6
‑
二羧酸，但是产量只有10 g/L（Yuichiro Otsuka, Masaya Nakamura, KiyotakaShigehara, Kosuke Sugimura, Eiji Masai, Seiji Ohara, Yoshihiro Katayama. Efficient production of 2
‑
pyrone 4,6
‑
dicarboxylic acid as a novel polymer
‑
based material from protocatechuate by microbial function. Applied Microbiology and Biotechnology. 2006, 71(5):608
‑
614.）。国外学者通过代谢工程手段，利用大肠杆菌（Escherichia coli）内源莽草酸途径合成3
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脱氢莽草酸，再整合外源合成途径基因，包括3
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脱氢莽草酸脱水酶基因quiC或asbF、原儿茶酸
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4,5
‑
二氧化酶基因ligAB或pmdAB、4
‑
羧基
‑2‑
羟基粘康酸
‑6‑
半醛脱氢酶基因ligC或pmdC，以葡萄糖为碳源，实现了从头合成2
‑
吡喃酮
‑
4,6
‑
二羧酸，但是最高产量只有16.7 g/L(Masahiro Nakajima, Yukari Nishino, Masatsugu Tamura, Kohei Mase, Eiji Masai, Yuichiro Otsuka, Masaya Nakamura, Kanna Sato, Masao Fukuda, KiyotakaShigehara, Seiji Ohara, Yoshihiro Katayama, Shinya Kajita. Microbial conversion of glucose to a novel chemical building block, 2
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pyrone
‑
4,6
‑
dicarboxylic acid. Metabolic Engineering. 2009,11: 213
–
220.; Zi Wei Luo, Won Jun Kim, Sang Yup Lee. Metabolic Engineering of Escherichia coli for Efficient Production of 2
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Pyrone
‑
4,6
‑
dicarboxylic Acid from Glucose. ACS Synthetic Biology. 2018, 7: 2296
−
2307.)。由此可见，利用微生物合成2
‑
吡喃酮
‑
4,6
‑
二羧酸的效率仍然较低，难以满足大规模工业化发酵生产的要求。本专利技术公开的生产方法可以有效解决2
‑
吡喃酮
‑
4,6
‑
二羧酸合成效率低的问题。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提供了一种高效全细胞催化生产2
‑
吡喃酮
‑
4,6
‑
二羧酸的方法及所用到的基因工程重组菌。
[0005]所述基因工程重组菌中共表达原儿茶酸
‑
4,5
‑
二氧化酶复合体（EC1.13.11.8）和4
‑
羧基
‑2‑
羟基粘康酸
‑6‑
半醛脱氢酶（EC1.1.1.312）基因的基因工程重组菌，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、需钠弧菌（Vibrio natriegens）等原核生物作为全细胞催化剂，以原儿茶酸作为底物，实现了原儿茶酸到2
‑
吡喃酮
‑
4,6
‑
二羧酸的全细胞催化合成（图1）。
[0006]在一种实施方式中，所述基因工程重组菌的构建选取大肠杆菌作为宿主细胞，通过载体共表达原儿茶酸
‑
4,5
‑
二氧化酶和4
‑
羧基
‑2‑
羟基粘康酸
‑6‑
半醛脱氢酶，获得全细胞催化剂。
[0007]在一种实施方式中，所述原儿茶酸
‑
4,5
‑
二氧化酶复合体的αβ亚基（命名为AB）和4
‑
羧基
‑2‑
羟基粘康酸
‑6‑
半醛脱氢酶（命名为C）大部分来源于变形菌门（Proteobacteria）
细菌，少部分来源于放线菌门（Actinobacteria）细菌；示例性地，通过蛋白同源性比对，在NCBI数据库中选取16组不同物种来源ABC催化酶，并将这些酶的编码基因序列按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化。具体地，原儿茶酸
‑
4,5
‑
二氧化酶复合体α亚基来源于NCBI登录号为TIX48797.1、MBO9517659.1、MBB5734100.1、QWT16175.1、MBE1527979.1、RIV77917.1、TCU95342.1、KAB0542660.1、ACB35890.1、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于全细胞催化生产2
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吡喃酮
‑
4,6
‑
二羧酸的基因工程重组菌，其特征在于，所述基因工程重组菌是通过在宿主细胞中共表达原儿茶酸
‑
4,5
‑
二氧化酶复合体的AB基因和4
‑
羧基
‑2‑
羟基粘康酸
‑6‑
半醛脱氢酶的C基因而获得，优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、需钠弧菌（Vibrio natriegens）。2.根据权利要求1所述的基因工程重组菌，其特征在于，所述原儿茶酸
‑
4,5
‑
二氧化酶复合体αβ亚基的AB基因和4
‑
羧基
‑2‑
羟基粘康酸
‑6‑
半醛脱氢酶的C基因来源于变形菌门（Proteobacteria）或放线菌门（Actinobacteria）的细菌；优选地，原儿茶酸
‑
4,5
‑
二氧化酶复合体α亚基来源于NCBI登录号为TIX48797.1、MBO9517659.1、MBB5734100.1、QWT16175.1、MBE1527979.1、RIV77917.1、TCU95342.1、KAB0542660.1、ACB35890.1、MBQ0919761.1、AXF85167.1、KQP37453.1、SKA71457.1、NHO66815.1；原儿茶酸
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4,5
‑
二氧化酶复合体β亚基来源于NCBI登录号为TIX48798.1、MBO9517658.1、MBB5734099.1、QWT16174.1、MBE1527978.1、RIV77918.1、TCU95343.1、KAB0542661.1、ACB35891.1、MBQ0919762.1、AXF85168.1、KQP37452.1、SKA71463.1、NHO66816.1；单亚基原儿茶酸
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4,5
‑
二氧化酶的NCBI登录号分别为EZP27614.1和AYG79827.1；4
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羧基
‑2‑
羟基粘康酸
‑6‑
半醛脱氢酶的NCBI登录号为TIX48799.1、MBO9517657.1、MBB5734098.1、QWT16173.1、MBE1527977.1、RIV77919.1、TCU95344.1、KAB0542662.1、ACB35892.1、MBQ0919763.1、AXF85169.1、KQP37451.1、SKA71468.1、NHO66817.1、EZP27613.1、AYG79828.1。3.根据权利要求2所述的基因工程重组菌，其特征在于，原儿茶酸
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4,5
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二氧化酶复合体αβ亚基编码基因AB和4
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羧基
‑2‑
羟基粘康酸
‑6‑
半醛脱氢酶编码基因C在基因组上以基因簇的形式排列，分别来源于NCBI中登录号为SSHH01000004.1、JAGIBN010000003.1、JACIJL010000010.1、CP076557.1、JADBDT010000001.1、QXFK01000016.1、SMBU01000015.1、VZPC01000007.1、CP001013.1、JAGPWB010000023.1、CP0...

【专利技术属性】
技术研发人员：王钦宏，吴凤礼，周丹，张媛媛，彭彦峰，陈五九，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：