一种大肠杆菌工程菌及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种大肠杆菌工程菌及应用，具体涉及一种大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J，所述大肠杆菌基因缺失菌种为大肠杆菌BL21中敲除了FadB基因、FadR基因和FadJ基因得到，利用大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J作为重组质粒pCDFDuet

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌工程菌及应用
[0001]本申请为申请号202110211118.9、申请日2021.02.25、专利技术名称“一种突变酶CYP153AM228L及其在合成10
‑
羟基
‑2‑
癸烯酸中的应用”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及一种大肠杆菌工程菌及应用，属于生物发酵


技术介绍

[0003]10
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羟基
‑2‑
癸烯酸(10
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hydroxy
‑2‑
decenoic acid，10
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HDA)是一种含有羟基的单不饱和脂肪酸，分子式为C
10
H
18
O3。迄今为止，自然界中仅从蜂王浆及蜂胶中发现，因此又称王浆酸。研究表明10
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HDA具有抗菌、免疫调节及抗氧化，抗肿瘤，降低血糖等多种重要的生理功能，具有极高的医药和保健价值，应用前景十分广泛。该化合物结构如下：
[0004]鉴于10
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HDA广泛而重要的应用价值，寻本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J，所述大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J为大肠杆菌BL21中敲除了FadB基因、FadR基因和FadJ基因得到。2.权利要求1所述大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J在制备10
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羟基
‑2‑
癸烯酸中的应用。3.权利要求1所述大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J的构建方法，包括如下步骤：Ⅰ利用RED重组法敲除基因，构建基因缺失ΔFadRB菌种；Ⅱ利用RED重组法敲除基因，构建大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J，具体包括构建FadJ敲除框；将FadJ敲除框转化进pkd46
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ΔFadRΔFadB感受态细胞中，制得大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J。4.如权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤Ⅱ中构建FadR敲除框，包括如下步骤：以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增3
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羟酰辅酶A脱氢酶基因的上游同源臂FadJ1，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增3
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羟酰辅酶A脱氢酶基因的下游同源臂FadJ2，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；以pkd3质粒为模板，扩增FRT
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RKan—FRT基因片段，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；然后将FadJl、FRT
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RKan
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FRT与FadJ2基因片段多片段无缝克隆，扩增FadJ1
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Kan
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FadJ2的敲除框片段，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示，纯化胶回收获得FadJ敲除框；优选的，PCR扩增体系如下，总体系50μL：100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH2O19μL；PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min15s，循环30次；72℃延伸5min。5.如权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤Ⅱ中FadJ敲除框转化入pkd46
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ΔFadRΔFadB重组菌，最终获得大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J，包括如下步骤：a、将质粒pkd46转化进ΔFadRΔFadB感受态细胞中，获得的pkd46
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ΔFadRΔFadB重组菌，制备pkd46
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ΔFadRΔFadB感受态细胞，再用质量浓度为10％的甘油保存制备的pkd46
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ΔFadRΔFadB感受态细胞；b、将FadJ敲除框Jk转化进pkd46
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ΔFadRΔFadB感受态细胞中，验证pkd46
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Jk
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BL21重组菌确认敲除框转入后，42℃消除pkd46，筛选后得到Jk
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ΔFadRΔFadB重组菌；c、将Jk
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ΔFadRΔFadB重组菌制备感受态转化pcp20质粒，42℃消除Jk抗性以及pcp20质粒，获得ΔFadRBJ重组菌，即为大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J。6.一种大肠杆菌BL21ΔFadB、R、J，pCDFDuet
‑1‑
MaMACS
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PpFadE、pET28a
‑
SUMO
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ctYdiI工程菌，由重组质粒pCDFDuet
‑1‑
MaMACS
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PpFadE、pET28a
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SUMO
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ctYdiI转化到权利要求1所述大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J构建得到；脂酰CoA合成酶基因MaMACS的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；脂酰CoA脱氢酶基因PpFadE的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；酯酰辅酶A硫酯酶基因ctYdiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
7.如权利要求6所述大肠杆菌BL21ΔFadB、R、J，pCDFDuet
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MaMACS
‑
PpFadE、pET28a
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SUMO
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ctYdiI工程菌，其特征在于，构建重组质粒pCDFDuet
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MaMACS
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PpFadE，包括如下步骤：以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增脂酰CoA脱氢酶基因PpFadE,上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏静，李岩，王瑞明，王丽，王蕾蕾，徐子淇，汪俊卿，刘孟连，宋子昂，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：