一种细菌外膜囊泡及其在制备先兆子痫治疗药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于纳米药物技术领域，具体涉及一种细菌外膜囊泡及其在制备先兆子痫治疗药物中的应用。本发明专利技术的细菌外膜囊泡，表面表达有plCSA

【技术实现步骤摘要】
一种细菌外膜囊泡及其在制备先兆子痫治疗药物中的应用


[0001]本专利技术属于纳米药物
，具体涉及一种细菌外膜囊泡及其在制备先兆子痫治疗药物中的应用。

技术介绍

[0002]妊娠并发症每年影响着数百万妇女，其中一些疾病具有严重的发病率和死亡率，例如先兆子痫(preeclampsia，PE)，它是全世界孕产妇及胎儿死亡的主要原因。PE的症状一般包括在怀孕20周以后出现高血压并发蛋白尿、水肿、多器官功能障碍以及胎儿宫内生长受限等，另外还有胎盘缺氧、氧化应激、血管生成失衡、过度炎症和内皮功能障碍等现象发生。如果不及时对孕妇进行干预治疗，病情逐渐发展导致多器官受累，可能会引发子痫、肾功能衰竭、HELLP综合征、胎盘早剥等严重的并发症，对母体和胎儿健康造成极其严重的威胁。
[0003]PE是一种与胎盘异常发育密切相关的疾病，目前仍旧没有兼顾安全与疗效的药物用于PE的治疗。例如，临床上常用的PE治疗药物包括如拉贝洛尔、硝苯地平、甘露醇等降压药以缓解高血压的症状；另外还有地西泮、硫酸镁等镇静解痉药物以缓解控制抽搐症状；也常用碳酸氢钠纠正抽搐后的酸中毒或者通过终止妊娠的方法保障母亲的生命安全。
[0004]但是，上述药物和治疗手段主要以预防和控制病情发展和恶化为主，没有从根源去治疗PE。并且PE患者即使在分娩后，仍有发生高血压，心肌病和长期肾脏疾病等产后并发症的可能。新生命的诞生与人类的未来息息相关，因此研发一种从根源上有效控制治疗PE，并且对产妇及胎儿毒副作用小的药物对人类健康发展具有重要意义。
专利
技术实现思路

[0005]基于解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种细菌外膜囊泡，其能够有效负载siRNA药物，主动胎盘靶向递送siRNA药物，有效治疗先兆子痫(PE)的同时更大程度地减少副作用。
[0006]本专利技术的目的还在于提供一种细菌外膜囊泡在制备先兆子痫治疗药物中的应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术的细菌外膜囊泡，采用如下技术方案实现：
[0008]一种细菌外膜囊泡，所述细菌外膜囊泡是通过大肠杆菌重组表达载体诱导表达、纯化得到，细菌外膜囊泡的表面表达有plCSA
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BP目标蛋白；所述大肠杆菌重组表达载体，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，表达载体在构建时，是将InaXN冰核蛋白、sfGFP绿色荧光蛋白和plCSA
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BP目标蛋白的编码基因构建成重组质粒后，转入减毒大肠杆菌得到。
[0009]现有研究表明，PE患者体内高表达的生长阻滞和DNA损伤45α基因(Growth arrest and DNA damage
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inducible 45alpha，Gadd45α)，其同时参与多种PE关键因子的调控，因此本专利技术考虑是否能够通过靶向调控Gadd45α的表达来实现多种因子共同作用以治疗PE。
[0010]siRNA是一种能靶向核酸的高效治疗药物，但极易降解、难以跨膜等缺点极大地限制了其临床应用。基因工程技术的进步使得利用工程化细菌外膜囊泡(OMVs)实现主动胎盘
靶向递送siRNA药物成为了可能。
[0011]基于上述构想，本专利技术首创性地设计构建了一种具有主动胎盘靶向性的减毒工程化细菌外膜囊泡用于递送针对Gadd45α的siRNA药物以治疗PE，以期实现有效治疗PE的同时更大程度地减少对产妇与胎儿的副作用。
[0012]本专利技术提供的细菌外膜囊泡，表面表达有plCSA
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BP蛋白。实验证实，本专利技术采用基因工程技术构建得到的OMVs，内毒素值低，表达量高，是一种更加安全的OMVs载体。并且，本专利技术提供的细菌外膜囊泡OMVs能实现对siRNA药物在体内的长效保护作用以及对胎盘的靶向作用，载药后能够有效地减缓子痫进程，在制备抗子痫药物方面具有良好的临床应用前景。
[0013]本专利技术制备细菌外膜囊泡所涉及的大肠杆菌重组表达载体中，InaXN冰核蛋白为冰核蛋白N末端结构域蛋白，sfGFP为超折叠绿色荧光蛋白(super fold Green fluorescent protein)，plCSA
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BP为胎盘硫酸软骨素A结合肽。本专利技术通过前期研究证实，采用InaXN冰核蛋白作为铆钉蛋白，可将sfGFP绿色荧光蛋白和pICS
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BP目标蛋白有效融合表达在细胞膜上。
[0014]大肠杆菌重组表达载体中含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，开放阅读框序列全长1326bp，依次编码InaXN冰核蛋白、sfGFP绿色荧光蛋白、pICS
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BP目标蛋白。其中1～528bp位点处为InaXN冰核蛋白编码基因(528bp)，529
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1242bp位点处为sfGFP绿色荧光蛋白编码基因(714bp)，1243～1326bp位点处为pICS
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BP目标蛋白编码基因(84bp)。
[0015]而为了使目标蛋白plCSA
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BP稳定表达于大肠杆菌以及OMVs表面，并有效提高OMVs的表达量，本专利技术通过将plCSA
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BP与InaXN冰核蛋白融合表达，并连接sfGFP作为指示蛋白，使得OMV表达量提高，并且具有绿色荧光可以在显微镜下被示踪，同时，表达得到OMV的既具有优于脂质体的特点，同时有更好的稳定性、生物相容性、安全性以及胎盘靶向性，是一种能有效保护siRNA的载体。
[0016]优选地，本专利技术所涉及的细菌外膜囊泡的粒径为20～80nm。
[0017]基于安全性的首要考虑，本专利技术采用的减毒大肠杆菌，为预先敲除了msbB基因的大肠杆菌。具体操作时，可采用CRISPR法敲除大肠杆菌msbB基因。本专利技术通过前期实验证实，通过msbB基因的预先敲除，能够有效降低表达产物的毒性，更利于产物安全性的提高。
[0018]产物的表达同时受培养温度、培养时间和诱导剂的多重影响。本专利技术在进行诱导剂、温度、时间筛选后，优选出，所述大肠杆菌重组表达载体在诱导表达细菌外膜囊泡时，诱导表达的条件为：含有0.1～1mM的异丙基β
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硫代吡喃半乳糖苷的LB液体培养基，20～30℃条件下诱导4～14h。进一步优选地，所述大肠杆菌重组表达载体在诱导表达细菌外膜囊泡时，诱导表达的条件为：含有1mM的异丙基β
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硫代吡喃半乳糖苷的LB液体培养基，30℃条件下诱导14h。
[0019]为提高OMVs分离回收效果，优选地，所述大肠杆菌表达载体在诱导表达细菌外膜囊泡后，采用超滤浓缩法对表达得到的细菌外膜囊泡进行提取和纯化。
[0020]本专利技术的细菌外膜囊泡在制备先兆子痫治疗药物中的应用的技术方案是：
[0021]一种细菌外膜囊泡在制备先兆子痫治疗药物中的应用，具体将所述细菌外膜囊泡作为载体负载siRNA药物构成载药纳米粒子从而制备先兆子痫治疗药物。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细菌外膜囊泡，其特征在于，所述细菌外膜囊泡是通过大肠杆菌重组表达载体诱导表达、纯化得到，细菌外膜囊泡的表面表达有plCSA
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BP目标蛋白；所述大肠杆菌重组表达载体，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，表达载体在构建时，是将InaXN冰核蛋白、sfGFP绿色荧光蛋白和plCSA
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BP目标蛋白的编码基因构建成重组质粒后，转入减毒大肠杆菌得到。2.如权利要求1所述的细菌外膜囊泡，其特征在于，所述细菌外膜囊泡的粒径为20～80nm。3.如权利要求1所述的细菌外膜囊泡，其特征在于，所述大肠杆菌重组表达载体在诱导表达细菌外膜囊泡时，诱导表达的条件为：含有0.1～1mM的异丙基β
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硫代吡喃半乳糖苷的LB液体培养基，20～30℃条件下诱导4～14h。4.如权利要求3所述的细菌外膜囊泡，其特征在于，所述大肠杆菌重组表达载体在诱导表达细菌外膜囊泡时，诱导表达的条件为：含有1mM的异丙基β
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，高兴丽，李淑丽，郭永然，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：