一种产3-羟基丙酸的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种产3

【技术实现步骤摘要】
一种产3
‑
羟基丙酸的基因工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种产3
‑
羟基丙酸的基因工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]3‑
羟基丙酸是一种重要的生物基平台化合物，作为生物可降解性聚合物的前体物质和食品添加剂广泛使用。3
‑
羟基丙酸的生产有化学合成法和生物法两种。化学法多以不可再生资源作为原料，其生产过程能耗大，产物副产物多难以分离纯化，生产过程产生不可估量的环境污染。生物法合成3
‑
羟基丙酸多以葡萄糖和甘油作为底物，其中以甘油作为底物生产3
‑
羟基丙酸因其步骤简单，原料廉价，备受瞩目。但是，生物法合成3
‑
羟基丙酸时，会产生毒性中间代谢物3
‑
羟基丙醛，毒性中间代谢物3
‑
羟基丙醛积累、昂贵的辅酶B
12
供应不足等问题限制了生物法合成3
‑
羟基丙酸的大规模生产。

技术实现思路

[0003]针对现有技术中存在的一些不足，本专利技术提供了一种产3
‑
羟基丙酸的基因工程菌及其构建方法和应用。本专利技术中，利用基因工程和合成生物学技术，通过在大肠杆菌中协同表达了乙醇脱氢酶AdhP和琥珀酸半醛脱氢酶GabD4，并在此基础上通过辅酶工程调控NADH氧化酶来提高辅酶NAD
+
循环供应，得到了重组的基因工程；所述基因工程菌能够以1,3<br/>‑
丙二醇为底物，在乙醇脱氢酶的作用下生成3
‑
羟基丙醛，然后经醛脱氢酶转化为3
‑
羟基丙酸；所述基因工程菌在没有维生素B
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的有氧条件下完成了细胞内辅酶自给自足，实现3
‑
羟基丙酸的有效生产。
[0004]本专利技术中首先提供了一种产3
‑
羟基丙酸的基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
[0005](1)协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌的构建：
[0006]PCR扩增来源于盐单胞菌的乙醇脱氢酶AdhP的基因片段，然后使用无缝克隆技术连接至pCDFDuet
‑
1质粒中，获得表达AdhP的重组质粒；
[0007]PCR扩增来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的基因片段，然后使用无缝克隆技术连接到表达AdhP的重组质粒中，得到协同表达AdhP和GabD4的重组质粒；
[0008]将协同表达AdhP和GabD4的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(STAR)中，然后筛选阳性克隆以及测序成功获得协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌；
[0009](2)产3
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羟基丙酸的基因工程菌的构建：
[0010]PCR扩增来源于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的NADH氧化酶NOX的基因片段，然后使用无缝克隆技术连接到pETDuet
‑
1质粒中，获得表达NOX的重组质粒；
[0011]将表达NOX的重组质粒转入步骤(1)中得到的协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌中，然后筛选阳性克隆以及测序成功获得产3
‑
羟基丙酸的基因工程菌。
[0012]其中，步骤(1)中，编码AdhP的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；
[0013]编码GabD4的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；
[0014]步骤(2)中，编码NOX的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
[0015]步骤(1)和(2)中，PCR反应参数均为：预变性98℃2min；变性98℃15s；退火55℃10s；延伸72℃2min；终延伸72℃5min，33个循环。
[0016]本专利技术中还提供了上述方法构建的产3
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羟基丙酸的基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株，先协同表达了乙醇脱氢酶AdhP和琥珀酸半醛脱氢酶GabD4，然后再表达了NADH氧化酶NOX基因。
[0017]本专利技术中还提供了上述产3
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羟基丙酸的基因工程菌在转化1,3
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丙二醇生产3
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羟基丙酸中的应用。
[0018]本专利技术中还提供了一种生产3
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羟基丙酸的方法，所述方法为利用上述产3
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羟基丙酸的基因工程菌的静息细胞转化1,3
‑
丙二醇生产3
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羟基丙酸。
[0019]具体的，所述应用为：将产3
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羟基丙酸的基因工程菌的静息细胞接种至1,3
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丙二醇中，在pH值为5～9、温度25～35℃、转速120～220rpm的条件下发酵生产3
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羟基丙酸。
[0020]其中，产3
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羟基丙酸的基因工程菌的静息细胞的接种量为15～25g/L。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0022]本专利技术中，通过乙醇脱氢酶AdhP和琥珀酸半醛脱氢酶GabD4，获得可转化1,3
‑
丙二醇生成3
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羟基丙酸的基因工程菌，然后通过辅因子工程技术表达NADH氧化酶NOX促进辅因子循环再生，进而促进3
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羟基丙酸的深入合成，实现利用1,3
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丙二醇生产3
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羟基丙酸的高效转化。
[0023]本专利技术中，将辅因子工程运用于生物合成，表达NADH氧化酶NOX来提高辅酶NAD
+
和NADH循环供应，具有重要的理论和实践意义，促进3
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羟基丙酸的高效生产。本专利技术中，摒弃了传统3
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羟基丙酸的生产方法，首次以1,3
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丙二醇为底物，通过协同表达构建3
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羟基丙酸合成途径，并运用辅酶工程策略实现胞内辅酶自给自足，具有重要的理论和实践意义，所构建的产3
‑
羟基丙酸的基因工程菌可高效转化1,3
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丙二醇生产3
‑
羟基丙酸，初步具有工业生产的潜力。
附图说明
[0024]图1为基因adhP的电泳图。
[0025]图2为基因gabD4的电泳图。
[0026]图3为基因nox的电泳图。
[0027]图4为基因工程菌FJ001和FJ002的3
‑
羟基丙酸产量图。
具体实施方式
[0028]下面结合附图以及具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术的保护范围并不限于此。下列实施例中未注明具体条件者，皆按照常本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产3
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羟基丙酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌协同表达乙醇脱氢酶AdhP、琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的基因，还表达NADH氧化酶NOX的基因。2.权利要求1所述的产3
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羟基丙酸的基因工程菌，其特征在于，包括：(1)协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌的构建：将乙醇脱氢酶AdhP的基因片段adhP连接至pCDFDuet
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1质粒中，获得表达AdhP的重组质粒；将琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的基因片段gabD4连接到表达AdhP的重组质粒中，得到协同表达AdhP和GabD4的重组质粒；将协同表达AdhP和GabD4的重组质粒转化到大肠杆菌中，获得协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌；(2)产3
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羟基丙酸的基因工程菌的构建：将NADH氧化酶NOX的基因片段nox连接到pETDuet
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1质粒中，获得表达NOX的重组质粒；将表达NOX的重组质粒转入步骤(1)中得到的协同表达AdhP和GabD4的基因工程菌中，获得产3
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羟基丙酸的基因工程菌。3.根据权利要求2所述的产3
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羟基丙酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乙醇脱氢酶AdhP的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，编码乙醇脱氢酶AdhP的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。4.根据权利要求2所述的产3
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羟基丙酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，编码GabD4的核苷酸序列如SEQ ID No:...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐向辉，窦媛，张宇飞，赵梅，翟彼得，尤瓦，孙雷，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：