一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株、构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株、构建方法及应用，所述突变株为AZC_0343基因缺失的茎瘤固氮根瘤菌；本发明专利技术以茎瘤固氮根瘤菌ORS571的基因组DNA为模板，分别以引物0343

【技术实现步骤摘要】
一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株、构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及农业微生物领域，具体涉及一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]氮是植物生长所需的三大主要营养素之一，作物体内蛋白质、酶、核酸、叶绿素、维生素等有机化合物的合成都离不开氮的参与。氮在大气中含量丰富(占79％左右)，但大多数植物无法直接利用氮气。农业生产中施用氮肥增产是缓解耕地资源不足、保证粮食品质的重要措施；然而，随着施氮量的进一步增加，农作物产量却不再增加，并且氮效率大幅度下降。研究表明过量施氮导致玉米叶片早衰，产籽量降低；并且长期过量施用氮肥会造成土壤板结，污染环境并影响土壤微生态。因此，科学使用肥料，开发新型绿色肥料保证农田可持续生产能力，促进农业绿色发展仍然是努力的方向。
[0003]微生物肥料因具有调节植物生长、增加作物产量、改善作物品质、减少化肥使用量、改良土壤、保护生态环境等特点受到广泛关注，成为绿色生态农业发展中不可替代的制胜法宝之一。固氮细菌与植物共生固氮的过程中将大气中的氮气转化为更容易被宿主植物利用的氨。茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)属于杆菌，是从豆科植物毛萼田菁茎瘤中分离到的固氮细菌，其细胞直径大于2.0μm且长短不一，呈卵圆状或类球状，其宿主特异性很强。ORS571除了可以和宿主植物共生固氮，还能够在微耗氧的条件下自生固氮或作为内生菌在其他植物体内固氮，为宿主植物增加获取氮源的途径。由此可见，茎瘤固氮根瘤菌ORS571应用于农业，具有不可替代的研究意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于，提供一种固氮效率高、具有显著促生效果的茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株、构建方法及应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株，所述突变株为σ
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因子调控基因AZC_0343缺失的茎瘤固氮根瘤菌，其出发菌株为茎瘤固氮根瘤菌ORS571。
[0007]所述突变株通过以下方法构建得到：
[0008](1)以茎瘤固氮根瘤菌ORS571为模板，分别以引物0343
‑
up
‑
F/R和引物0343
‑
down
‑
F/R扩增茎瘤固氮根瘤菌AZC_0343基因的上游片段AZC_0343
‑
up和下游片段AZC_0343
‑
down；
[0009](2)酶切酶连构建重组质粒pCM351::AZC_0343up
‑
down；
[0010](3)将上述重组质粒导入大肠杆菌DH5α，并通过三亲接合方法和同源重组原理导入茎瘤固氮根瘤菌ORS571；
[0011](4)使用同时含有氨苄青霉素和庆大霉素抗性的TY固体培养基筛选阳性接合子，并通过PCR验证获得AZC_0343基因敲除的茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株。
[0012]优选地，步骤(1)中所述引物具体为：
[0013]0343
‑
up
‑
F：GGTACCGCTCCACGATCATCTGCTG；
[0014]0343
‑
up
‑
R：CATATGCCATCGAAATACTTGCCGAC；
[0015]0343
‑
down
‑
F：GGGCCCGTGGTGGTCTTCCGCCATG；
[0016]0343
‑
down
‑
R：GAGCTCGAGGAGCGCGTAGATGTCC。
[0017]优选地，步骤(2)具体为：将步骤(1)扩增得到的所述上游片段AZC_0343
‑
up连接到pEASY Simple上，分别用Kpn I和Nde I限制性内切酶进行酶切，收集目的片段与经Kpn I和Nde I酶切的pCM351片段连接，连接后转入大肠杆菌筛选阳性重组子，获得pCM351:AZC_0343
‑
up质粒；
[0018]将步骤(1)扩增得到的下游片段AZC_0343
‑
down连接到pEASY Simple上，分别用Apa I和Sac I限制性内切酶双酶切AZC_0343
‑
down片段和pCM351:AZC_0343
‑
up质粒，收集并将经Apa I和Sac I双酶切的AZC_0343
‑
down片段和pCM351:AZC_0343
‑
up质粒连接，连接后转入大肠杆菌筛选阳性重组子，获得重组质粒pCM351::AZC_0343up
‑
down。
[0019]优选地，步骤(3)中所述的三亲接合方法具体指的是：将含有重组质粒的DH5α供体菌、含有辅助质粒pRK2013的DH5α辅助菌和茎瘤固氮根瘤菌ORS571分别在LB液体培养基(适用于大肠杆菌DH5α)和TY液体培养基(适用于ORS571)中于37℃条件下培养至OD
600
＝0.6；
[0020]然后将供体菌、辅助菌和受体菌按3:2:1的体积比混合，4500rpm离心5min，倒掉上清，将剩余的100μL上清重悬菌体悬滴于LB固体培养基，于37℃条件下培养48h进行三亲接合。
[0021]优选地，步骤(3)中所述的同源重组原理具体指的是：三亲接合过程中，重组质粒pCM351::AZC_0343up
‑
down导入茎瘤固氮根瘤菌ORS571并与菌株ORS571基因组靠近，两个DNA分子的同源序列自发进行重新组合得重组后的接合子。
[0022]优选地，步骤(4)具体为：将步骤(3)得到的重组后的接合子在同时含有氨苄青霉素和庆大霉素的TY固体培养基上培养，筛选可以在同时含有氨苄青霉素和庆大霉素的TY固体培养基上生长的阳性接合子，通过PCR验证获得所述突变株。
[0023]本专利技术的另一目的在于，提供上述突变株在促进玉米生长中的应用。
[0024]优选地，所述突变株在促进玉米生长中作为接种剂或微生物菌肥的应用，具体如下：
[0025]在TY培养基中37℃条件下过夜培养所述突变株，将其作为接种剂(促生剂)浸泡发芽的玉米种子30min后，将玉米种子转移至灭菌的拌有低氮营养液的蛭石中，于26℃，光照周期12h:12h条件下培养，促进玉米生长。
[0026]所述低氮营养液配方是柠檬酸铁0.075g/L，硝酸钙0.03g/L，氯化钾0.075g/L，硫酸镁0.06g/L，磷酸氢钾0.136g/L，硫酸钙0.46g/L，微量元素混合液1mL。
[0027]所述微量元素混合液组分为硼酸2.86g/L，硫酸锰1.81g/L，五水硫酸铜0.8g/L，硫酸锌0.22g/L，钼酸0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株，其特征在于，所述突变株为σ
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因子调控基因AZC_0343缺失的茎瘤固氮根瘤菌。2.权利要求1所述突变株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以茎瘤固氮根瘤菌ORS571的基因组DNA为模板，分别以0343
‑
up
‑
F/R为引物扩增茎瘤固氮根瘤菌AZC_0343基因的上游片段AZC_0343
‑
up，以0343
‑
down
‑
F/R为引物扩增茎瘤固氮根瘤菌AZC_0343基因的下游片段AZC_0343
‑
down；(2)酶切酶连构建重组质粒pCM351::AZC_0343up
‑
down；(3)将上述重组质粒导入大肠杆菌DH5α，并通过三亲接合方法和同源重组原理导入茎瘤固氮根瘤菌ORS571；(4)使用同时含有氨苄青霉素和庆大霉素抗性的TY固体培养基筛选阳性接合子，并通过PCR验证获得AZC_0343基因敲除的茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株。3.根据权利要求2所述的突变株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述引物具体为：0343
‑
up
‑
F：GGTACCGCTCCACGATCATCTGCTG；0343
‑
up
‑
R：CATATGCCATCGAAATACTTGCCGAC；0343
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down
‑
F：GGGCCCGTGGTGGTCTTCCGCCATG；0343
‑
down
‑
R：GAGCTCGAGGAGCGCGTAGATGTCC。4.根据权利要求2所述的突变株的构建方法，其特征在于，步骤(2)具体为：将步骤(1)扩增得到的所述上游片段AZC_0343
‑
up连接到pEASY Sim...

【专利技术属性】
技术研发人员：解志红，孙丽，王丹丹，殷志秋，黄炜娓，耿全政，赵红玲，
申请(专利权)人：山东蓬勃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：