【技术实现步骤摘要】
一种含有能表达痢疾志贺氏菌O抗原的脂多糖的沙门菌、制备方法及其应用
[0001]本专利技术涉及物技术、基因工程和微生物发酵领域，具体涉及一种含有能表达痢疾志贺氏菌O抗原的脂多糖的沙门菌、制备方法及其应用。
技术介绍
[0002]志贺氏菌属(Shigella spp.)细菌是一类具有高度传染性以及致病性，并且会引起人类严重腹泻甚至死亡的革兰氏阴性菌，俗称痢疾杆菌。痢疾是一种全世界范围内高发的肠道传染病，据保守估计，全世界每年的感染人数超过1.6亿，死亡人数超过110万人。痢疾尤其在发展中国家尤其多发，在中国，几乎每年都有2000万人次感染痢疾，年累计发病数一直位于第三位，仅次于肺结核和乙肝，痢疾的防治是一个无法忽视的问题。
[0003]随着抗生素耐药性问题越来越严重，疫苗防治细菌感染已然成为趋势。尽管现阶段没有找到一种令人满意的痢疾疫苗，但研究已经发现了一些具有潜力的候选疫苗靶标，其中志贺氏菌的脂多糖(Lipopolysaccharide) 能够表现较好的保护力，有研究证明志贺氏菌脂多糖与蛋白的复合体能够激发小鼠很高的血清抗体滴度，并且能够表现一定的保护力，临床实验表明，福氏2a(Shigella flexneri 2a)的O抗原多糖能够引起特异的免疫保护，但脂多糖最关键的问题在于进入宿主体内，不能有效的到达宿主免疫系统被免疫系统识别，从而有一定概率导致免疫失败。若能解决该问题，脂多糖有潜力发展成为一种高效的疫苗靶标。脂多糖是大多数革兰氏阴性菌主要的毒力因子，也是细菌外膜的重要组成成分，由O
‑>抗原(O antigen)、核心多糖(core polysaccharide)以及内脂A(lipid A)组成。通过对沙门菌以及志贺氏菌的脂多糖合成基因簇比较可以发现，其O抗原基因簇在结构上略有不同，但O抗原合成结合于核心多糖位点上所用的酶均为RfaL，在沙门菌外膜上合成志贺氏菌的O抗原，并在合成途径中结合于沙门菌的核心寡糖上成为可能。有研究利用类似的策略在肠炎沙门菌中表达了大肠杆菌O78的O抗原基因簇，并且通过动物实验表明通过沙门菌递呈的O抗原能够刺激机体产生特异性的免疫反应。
[0004]沙门菌外膜囊泡已经被证明是一种高效的递呈载体，并且有研究证明通过沙门菌外膜囊泡递呈的PspA蛋白能够刺激宿主产生较好的免疫反应，并且提供一定的保护力。外膜囊泡由于其脂质双分子层的特性可以包裹递呈抗原不被机体过快清除，同时能够刺激机体引起免疫保护性反应并且避免减毒活疫苗以及灭活疫苗的安全风险，并将蛋白递呈至宿主深处从而更好的刺激机体产生免疫保护，因此外膜囊泡可以作为一种高效的抗原递呈载体。理想的外膜囊泡递呈载体应该具有以下特性：1)外膜囊泡载体本身能够刺激宿主产生良好的免疫保护反应，但尽可能的避免无意义的免疫反应干扰所递呈的外源抗原；2)尽可能的简化外膜囊泡的纯化步骤，并尽可能的产生大量的外膜囊泡可以降低生产成本；3)载体本身可以作为佐剂协助所递呈的抗原被宿主免疫系统所识别，从而发挥更大的功效。
[0005]外膜囊泡疫苗由于其有诸多不可比拟的优势，已经成为多种致病菌疫苗研究的热点。但现阶段大多数致病菌外膜囊泡疫苗更多的只是停留在对其野生型菌株的外膜囊泡进
行评估，而对外膜囊泡作为疫苗载体也更多的是停留在无毒性的大肠杆菌工程菌上进行研究。外膜囊泡疫苗在全世界范围内正处于上升期的研究热点，而在国内，这方面研究几乎一片空白。若能够成功开发出基于外膜囊泡的疫苗递呈平台，无论是在基础研究还是在转化应用方面均具有巨大的前景。。
技术实现思路
[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了针对现有方法的不足，本专利技术要解决的问题是提供一株重组沙门菌，其可以表达痢疾志贺氏菌O抗原的胞外多糖，以其为平台可以制备抗痢疾志贺氏菌的糖蛋白疫苗，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
[0007]一种含有能表达痢疾志贺氏菌O抗原的脂多糖的沙门菌，其特征在于：所述脂多糖表达在重组沙门菌的外膜囊泡上，所述沙门菌通过基因改造去掉沙门菌自身O抗原；去掉干扰沙门菌外膜囊泡免疫反应的FliC和FljB 鞭毛蛋白；去掉沙门菌自身非必须的外膜蛋白OmpA、OmpC和OmpD。
[0008]优选地、所述沙门菌进一步还包含：过量表达控制lipid A合成去酰基化的酶pagL(ΔpagL::P
trc
pagL)的突变，该突变将野生型lipid A结构变成单磷酸lipid A结构，降低lipid A被TLR4识别的能力。
[0009]含有能表达痢疾志贺氏菌O抗原的脂多糖的沙门菌的构建方法，步骤是：
[0010](1)以pYA3337为模板质粒进行表达质粒的构建，该质粒中包含pSC101 复制子，以及asd原件，与基因组敲除的asd基因构成平衡致死系；
[0011](2)采用合成生物学的方法构建含有志贺氏菌O抗原基因簇质粒：通过酵母重组系统或试剂盒Gibson assembly kit from NEB两种策略设计重叠片段(overlap)，用高保真PCR扩增得到目的片段和载体片段，利用不同的组装系统从而组装成完整的质粒。所有质粒构建操作将选用DH5α和 c6097(DH5α的asd缺陷型)作为质粒繁殖宿主；
[0012](3)构建表达痢疾志贺氏菌O抗原的脂多糖的沙门菌：将构建好的质粒转入构建好的鼠伤寒沙门菌外膜囊泡突变株内，同时测定该重组疫苗的生物学特性评估异源多糖表达对沙门菌外膜囊泡的影响。
[0013]含有能表达痢疾志贺氏菌O抗原的脂多糖的沙门菌在制备抗痢疾志贺氏菌疫苗中及其在制备高效多糖递呈平台的应用。
[0014]有益效果：
[0015]本专利技术的技术方案是基于痢疾志贺氏菌和沙门菌的脂多糖(LPS)的结构和合成途径相似的特点，采用在沙门菌中表达来源于痢疾志贺氏菌O抗原的脂多糖，同时通过基因改造去掉沙门菌自身O抗原；去掉干扰沙门菌外膜囊泡免疫反应的FliC和FljB鞭毛蛋白；去掉沙门菌自身非必须的外膜蛋白OmpA、OmpC和OmpD。
附图说明
[0016]图1是构建能表达痢疾志贺氏菌O抗原的脂多糖的沙门菌的思路图；
[0017]图2是构建沙门菌的技术路线图；
[0018]图3是志贺氏菌O抗原多糖抗原表达质粒构建图；
[0019]图4是评价外膜囊泡抗原蛋白递呈效率动物实验流程图；
[0020]图5是IgA抗体含量分析结果图。
具体实施方式
[0021]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0022]根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本专利技术的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本专利技术的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种含有能表达痢疾志贺氏菌O抗原的脂多糖的沙门菌，其特征在于：所述脂多糖表达在重组沙门菌的外膜囊泡上，所述沙门菌通过基因改造去掉沙门菌自身O抗原；去掉干扰沙门菌外膜囊泡免疫反应的FliC和FljB鞭毛蛋白；去掉沙门菌自身非必须的外膜蛋白OmpA、OmpC和OmpD。2.根据权利要求1所述的沙门菌，其特征在于：所述沙门菌包括：过量表达控制lipid A合成去酰基化的酶pagL的突变，该突变将野生型lipid A结构变成单磷酸lipid A结构，降低lipid A被TLR4识别的能力。3.一种制备权利要求1
‑
2任一项所述的含有能表达痢疾志贺氏菌O抗原的脂多糖的沙门菌的方法，包括以下步骤：(1)以pYA3337为模板质粒进行表达质粒的构建，所述质粒中包含pSC101复制子，...
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