一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L

【技术实现步骤摘要】
一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L
‑
乳酸的工程菌及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及微生物学、生物化学和发酵工程
，特别涉及一株产高光学纯度L
‑
乳酸的工程菌及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]乳酸作为在食品，医药，化工，农药等行业的重要原料，具有巨大的生产经济价值。据报道，2016年全球乳酸总产量达到122万吨，并且每年以16.2％的比例增长。作为以L
‑
乳酸为原料生产的高附加值产品聚L
‑
乳酸(L
‑
PLA)，由于其无毒、无刺激性、生物相容性好、且易降解的特点，在食品，医药以及化妆品行业的应用也越来越广泛。如用于合成植入人体内的固定材料，外科手术缝合线，生物可分解的食品包装容器及器具，化妆品包装材料等。
[0003]微生物发酵法由于原料来源广泛、生产成本低、产量高，对环境友好等优点现已成为国内外生产L
‑
乳酸的主要方法。由于人体只能代谢L
‑
乳酸，而无法代谢D
‑
乳酸，因此L
‑
乳酸光学纯度的高低决定了其用于合成L
‑
PLA的附加价值与应用范围，特别是涉及到应用于人体的相关产业和产品。在微生物发酵生产L
‑
乳酸时，一般要求光学纯度不低于99.5％，且越高越好。
[0004]因此，为了提高L
‑
乳酸的光学纯度，有必要提供开发一种双厌氧启动子诱导产高光学纯L
>‑
乳酸的工程菌及发酵生产高光学纯度L
‑
乳酸的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L
‑
乳酸的工程菌及其制备方法与应用，该菌株应用于L
‑
乳酸发酵生产时，在全程厌氧发酵条件下，能有效消除发酵罐中的D
‑
乳酸，使目的产物L
‑
乳酸的光学纯度和糖酸转化率显著提高。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供了一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L
‑
乳酸的工程菌，所述双厌氧启动子诱导产高光学纯L
‑
乳酸的工程菌为Escherichia coli HBUT
‑
L
‑
LND，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022456。
[0007]在本专利技术的第二方面，提供了所述的工程菌在发酵产高光学纯度L
‑
乳酸中的应用。
[0008]在本专利技术的第三方面，提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包括：
[0009]将所述的双厌氧启动子诱导产高光学纯L
‑
乳酸的工程菌进行发酵获得的发酵液；
[0010]或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。
[0011]在本专利技术的第四方面，提供了所述工程菌的制备方法，所述方法包括：
[0012]以野生型E.coli W的基因组为模板，以SEQ ID NO.4
‑
SEQ ID NO.5所示的引物对进行扩增，获得片段1；
[0013]以野生型E.coli W的基因组为模板，以SEQ ID NO.6
‑
SEQ ID NO.7所示的引物对进行扩增，获得片段2；
[0014]将所述片段1和所述片段2为模板，以SEQ ID NO.8
‑
SEQ ID NO.9所示的引物对进行扩增，获得片段3；将所述片段3进行TA克隆并筛选阳性克隆，获得质粒pJH
‑
ndld；
[0015]以所述质粒pJH
‑
ndld为模板，以SEQ ID NO.10
‑
SEQ ID NO.11所示的引物对进行扩增，并通过切胶回收纯化，获得片段4；
[0016]使用限制性内切酶Hind III对质粒pAGI02进行酶切，并通过切胶回收纯化，获得带有pflBp6的线性化质粒片段；
[0017]将所述片段4与所述带有pflBp6的线性化质粒片段进行无缝克隆，得到双厌氧启动子pflBp6和nirBp调控dld基因的质粒pJH
‑
pndld；
[0018]将所述质粒pJH
‑
pndld化转入菌株E.coli HBUT
‑
L16，获得所述工程菌。
[0019]在本专利技术的第五方面，提供了采用所述的工程菌发酵高产光学纯L
‑
乳酸的方法，所述方法包括：
[0020]将所述的双厌氧启动子诱导产高光学纯L
‑
乳酸的工程菌接种于种子培养基中进行种子培养，获得活化菌液；
[0021]将所述活化菌液接种于发酵培养基中进行发酵培养，获得光学纯L
‑
乳酸。
[0022]进一步地，所述种子培养基的配方为：添加4wt％葡萄糖的LB培养基；所述种子培养的条件为温度37
±
0.5℃，转速200
±
20r/min。
[0023]进一步地，所述发酵培养基的配方为：1/5LB培养基，12wt％葡萄糖，添加3g/L D
‑
乳酸；所述发酵培养的条件为温度37
±
0.5℃，200
±
20r/min，且所述发酵培养采用厌氧发酵：即添加23wt％氢氧化钙。
[0024]进一步地，所述活化菌液的OD
600
至3
‑
4时接种于发酵培养基中进行发酵培养。
[0025]进一步地，所述发酵培养中采用5
‑
20％的接种量。
[0026]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0027]1、本专利技术通过双启动子稳定增强醌依赖性D
‑
乳酸脱氢酶在厌氧条件下的表达，其效果明显优于单厌氧启动子的效果。通过酶活检测发现，单厌氧启动子对醌依赖性D
‑
乳酸脱氢酶的单位酶活提高到3.73倍，而双厌氧启动子提高到5.27倍。
[0028]2、本专利技术采用的双启动子表达系统是自诱导型表达系统，不需要添加任何诱导剂，使发酵产品适宜用于食品医药等行业的应用。
[0029]3、本专利技术应用于L
‑
乳酸发酵生产时，在全程厌氧发酵条件下，能有效消除发酵罐中的D
‑
乳酸，使目的产物L
‑
乳酸的光学纯度和糖酸转化率显著提高。通过分批发酵实验表明，工程菌E.coli HBUT
‑
L
‑
LND在20h内可发酵完成，发酵液中含乳酸量为106g/L，糖酸转化率达≥95％。在培养液中添加3g/L的D
‑
乳酸分批发酵表明，出发菌株HBUT
‑
L16发酵完成后发酵液中L
‑
乳酸光学纯度为97.12...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L
‑
乳酸的工程菌，其特征在于，所述双厌氧启动子诱导产高光学纯L
‑
乳酸的工程菌为Escherichia coli HBUT
‑
L
‑
LND，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022456。2.一种权利要求1所述的工程菌在发酵高产光学纯L
‑
乳酸中的应用。3.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包括：将如权利要求1所述的双厌氧启动子诱导产高光学纯L
‑
乳酸的工程菌进行发酵获得的发酵液；或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。4.一种权利要求1所述的工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括：以野生型E.coli W的基因组为模板，以SEQ ID NO.4
‑
SEQ ID NO.5所示的引物对进行扩增，获得片段1；以野生型E.coli W的基因组为模板，以SEQ ID NO.6
‑
SEQ ID NO.7所示的引物对进行扩增，获得片段2；将所述片段1和所述片段2为模板，以SEQ ID NO.8
‑
SEQ ID NO.9所示的引物对进行扩增，获得片段3；将所述片段3进行TA克隆并筛选阳性克隆，获得质粒pJH
‑
ndld；以所述质粒pJH
‑
ndld为模板，以SEQ ID NO.10
‑
SEQ ID NO.11所示的引物对进行扩增，并通过切胶回收纯化，获得片段4；使用限制性内切酶Hind III对质粒pAGI02进行酶切，并通过切胶回收纯化，获得带有pflBp6的线性化质...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金华，赵筱，王永泽，张正，黄金成，许克强，余杰，刘宗求，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：