一种用于检测乳腺癌的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测乳腺癌的试剂盒，其含有能与P185特异性结合的多肽。所述的多肽具有良好的生物活性。该多肽能够用于筛查乳腺癌肿瘤病人，也可以单独抑制乳腺癌细胞的增殖。

A kit for detecting breast cancer

The present invention relates to a kit for detecting breast cancer, which contains a polypeptide that can specifically bind to P185. The polypeptide has good biological activity. The peptide can be used to screen breast cancer patients and can also inhibit the proliferation of breast cancer cells alone.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测乳腺癌的试剂盒
本专利技术涉及检测
，具体涉及一种用于检测乳腺癌的试剂盒。
技术介绍
HER-2/neu基因，又名c-erbB2，定位于人染色体12q21，编码相对分子质量约为18500的跨膜糖蛋白p185，p185包含1225个氨基酸残基，由信号肽、胞外区、跨膜区及胞内区4个部分组成。在乳腺、卵巢、肺、胃、前列腺等10余种癌症中均显示部分患者有过量表达，作为一个重要的肿瘤表面标志蛋白，尤其对乳腺癌，已被国际公认是重要的临床指标。目前，国内外已有上市的免疫组化试剂盒和药物用于检测和靶向治疗乳腺癌。美国《基因》杂志(Gene，1995.159：19-27)综述大量临床研究结果后指出，当细胞膜P185neu/c-erbB-2高表达即over-expression时，说明该肿瘤的恶性程度高，术后易发生转移和复发。因此制备临床诊断肿瘤组织中P185表达水平的单克隆抗体具有很重要的意义。目前，国内外针对P185主要制备的单克隆抗体授权的专利有很多，比如CN1118568C中公开的抗P185neu/c-erbB-2单克隆抗体杂交瘤A18、A21和A22所分泌的抗体A18、A21和A22，用于检测肿瘤组织上P185neu/c-erbB-2的表达水平，其单抗的特异性强，阳性染色为膜着色，背景低，适宜用于临床病理切片的免疫组化检测，也可能发展到病人血清的检测。CN1238381C针对肿瘤表面抗原p185的单链抗体-人scFv-Fc嵌合抗体及其制备方法，特征是采用表面表位包埋法免疫后制备的杂交瘤细胞株，以单链嵌合抗体基因的形式转染哺乳动物细胞CHO，采用pEE14作为重组抗体的载体，用它携带基因转染到GS低表达的哺乳动物细胞CHO中，将高表达重组抗体的CHO细胞株筛选出来；本专利技术的嵌合抗体分子仅由两条相同的重组单链组成，每条重组单链有一的抗原结合区，由重链和轻链可变区共价连接在一起，构成了识别抗原的单链抗体；由于去除了轻链恒定区和重链恒定区的CH1结构域，比完整抗体的分子量小了近三分之一，既更容易透过血管系屏障渗透进实体瘤的内部，又不像小的蛋白多肽药物那样容易很快被降解，从而能更好地发挥抑制肿瘤生长的作用。目前最常用的P185蛋白检测方法有酶联免疫吸附测定ELISA，荧光原位杂交FISH以及免疫组化学法IHC。其中ELISA法简单、敏感，但是制备单克隆抗体比较复杂。FISH法灵敏度更高，因DNA的相对稳定而使检查结果可靠，但是价格昂贵，技术复杂。IHC相对而言，是目前检查HER-2蛋白水平最常用的方法，但是基于对照高表达组织的来源以及数量有限，不适宜大规模使用，导致肿瘤蛋白在筛查，复查，控制预后方面的临床应用受限。目前在医药市场上，针对P185相关的HER2相关的单抗已经在国内外上市，具有巨大的市场空间。基于单克隆抗体研发的高投入以及不稳定性，为了开拓国内的市场，研发新的能够特异性结合P185的相关抑制剂及检测剂变得尤其具有市场价值。根据蛋白的空间结构设计多肽，从而在三维结构上抑制蛋白的功能是目前研究的热点，并且也有多个产品已经上市。基于P185抗体研究的高投入和不确定性，针对P185的特异性抑制肽或结合肽的研究也是一个新的研究方向。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术人经过大量试验和艰辛的劳动发现了一种短肽抑制剂，其对P185具有显著的抑制作用，可用作治疗和/或预防与P185有关的疾病的药物活性成分。因此，本专利技术的目的在于提供一种短肽抑制剂及其用途。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案:一方面提供了一种抑制肽的计算机辅助设计获得方法，所述计算机软件是申请人自主开发设计的peptidedesigner，所述设计方法为设置长度为25-150个氨基酸的随机短肽使其在P185蛋白分子表面游走，并通过电荷改变肽段与P185的相对位置，快速计算该肽段上各个原子和蛋白表面相邻原子的作用力，以及移动、扭转肽段产生的能量变化；并反复优化比较各种可能的结合方式，选择能量最低的，做为定构象。依据相互作用原子的距离和空间关系得出多肽同P185分子的结合位点、参与的原子基团以及作用方式，最终筛选得到16个结合性和抑制性最高的抑制肽序列，采用生物实验最终确定2个抑制肽具有最好的抑制效果。在另外一方面，本专利技术提供一种短肽抑制剂，其序列中为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。优选地，所述短肽抑制剂的序列在N段采用酰胺化修饰，C端连接聚乙二醇修饰。本专利技术另外一方面，提供一种抑制肽-纳米颗粒复合系统，通过以下方式制备与修饰的:(1)抑制肽:通过Fmoc/叔丁基策略和HOBt/TBTU/NMM偶联的方法化学合成制备(也可直接由生物公司合成)；(2)60nm金纳米微球的合成:利用梓檬酸钠还原法一步合成18nm金颗粒；(3)金纳米棒的合成:利用种子生长法合成金纳米棒；(4)纳米金颗粒的表面多肽修饰；(5)修饰后纳米金颗粒的表征:经修饰的金颗粒的物理化学性质可通过测量其光谱以及Zeta-电势来表征。在又一个方面，本专利技术提供了药物组合物，其包含本专利技术的抗PD-1抑制剂，以及可药用载体。在又一个方面，本专利技术提供了用于在有需要的对象中治疗或预防癌症或感染性疾病的方法，其包括将本专利技术的多肽/或药物组合物施用给所述对象。在又一个方面，本专利技术提供一种肿瘤蛋白P185检测试剂盒，其特征在于:包括肿瘤蛋白P185结合肽、酶标板、阳性对照品、阴性对照品、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素及其显色底物，所述的肿瘤蛋白P185结合肽包括包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185结合肽和生物素标记的肿瘤蛋白P185结合肽。其中，所述的洗涤液是由28.5g的Na2HPO4.12H2O、80g的NaCl、3.9g的NaH2PO4.2H20和50ml的Tween-20加入纯化水溶解定容至1000ml所得。另外一方面，所述的显色底物包括显色液A和显色液B，所述的显色液A是用柠檬酸缓冲液将30％过氧化氢稀释1000倍所得，所述的显色液B为用含20％二甲基亚砜的柠檬酸缓冲液将四甲基联苯胺配制成0.4mg/ml所得。另外一方面，所述的终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。另外一方面，所述的阳性对照品、阴性对照品分别为人体的P185阳性血清、P185阴性血清。本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术所述的多肽其与P185蛋白具有高度亲和力(亲和力KD<1×10-12M)，能够结合P185蛋白胞外区，并能够在蛋白水平和细胞水平有效封闭P185蛋白，阻止P185蛋白与目的蛋白的结合。所述的多肽具有良好的生物活性。该多肽可以单独或与抗P185单克隆抗体或其它抗肿瘤药物联合的肿瘤免疫治疗和肿瘤病人的诊断和筛查中，即能够运用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等药物的制备中。附图说明图1是肿瘤体积和P185-1用药时间关系图。图2是肿瘤体积和单抗用药时间关系图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述，但它们不是对本专利技术的进一步限制。实施例一:抑制肽的获得专利技术人根据自己设计的抑制肽的计算机辅助设计方法peptidedesigner来设计相应的抑制肽，所述设计方法为设置长度为25-150个氨基酸的随机短肽使其在P185蛋白分子表面游走，并通过电荷改变肽段与P185的相对位置，快本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测乳腺癌的试剂盒,其特征在于：其含有能与P185特异性结合的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测乳腺癌的试剂盒,其特征在于：其含有能与P185特异性结合的多肽。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述多肽序列如SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王振，张成，
申请(专利权)人：苏州立豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32