一种用于检测少精子症的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测少精子症的试剂盒,其含有能够检测与少精症相关的分子标记的检测试剂，具体的涉及检测的位点为CRKL基因片段，其序列存在t/c突变时诊断为少精症患者。本发明专利技术试剂盒的优点和有益效果为利用设计的特定性引物，采用PCR技术，因此它的检测灵敏度很高。具有很高的准确性，特异性好、假阳性低。操作简单、安全、自动化程度高、防污染。速度快、高通量，可在2‑3小时完成。经济、便捷，便于临床广泛开展，节省患者开支，能够批量化检测。

A Kit for Detecting Oligozoospermia

The invention discloses a kit for detecting oligozoospermia, which contains a testing agent capable of detecting molecular markers related to oligozoospermia, and specifically relates to the detection site of CRKL gene fragment, whose sequence is diagnosed as oligozoospermia patient when t/c mutation exists. The advantages and beneficial effects of the kit are that the designed specific primers are utilized and the PCR technology is adopted, so the detection sensitivity of the kit is very high. It has high accuracy, good specificity and low false positive. Simple operation, safety, high degree of automation, pollution prevention. Fast speed, high throughput, can be completed in 2 to 3 hours. It is economical, convenient, easy to carry out clinically, save patients'expenses, and can be tested in batches.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测少精子症的试剂盒专利
本专利技术涉及检测
，具体涉及一种用于检测少精子症的试剂盒。
技术介绍
少精弱精症是指精子运动力差甚至无活动能力。在男性中，少精弱精症是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。弱精症的原因比较多，是否造成不育，要看弱精症的程度。如果是轻度的弱精症一般对生育没有大的影响，如果是严重的弱精症要做进一步的检查，看看引起弱精症的原因，有没有前列腺炎导致的弱精症，有没有免疫因素导致的弱精症，查明弱精症的原因后针对病因治疗弱精症。少、弱精子症主要有下列病因引起：①附睾、精囊、前列腺等器官的炎症引起精浆变异，影响精子活动和存活。②精索静脉曲张，睾丸局部因静脉血液回流障碍而缺氧，引起精子活动力降低。③微量元素缺乏影响精子活动力。④睾丸发育受阻，睾丸生精上皮不完全成熟或受损变薄，致使精子质量差，活力减弱。⑤精液量不足影响精子活动。⑥体内产生抗精子抗体，使精子凝集或制动。特发性精子减少，促性腺激素缺乏，膏酮分泌不足，性腺功能低下，影响曲细精管上皮生精，支持细胞提供各级精细胞营养。长期大量注射雄激素，使得下丘脑促性腺激素释放激素的减少，促性腺激素分泌降低，导致暂时性精子减少或消失。染色体异常，染色体畸变特别是性染色体畸变，对精子密度、活动率、前向运动率及形态均有严重影响，故对精子密度低于l000万/ml者都应作染色体分析。自身免疫，自身免疫可以通过二种途径造成少精子症：①自身免疫影响精子的发生使生殖细胞脱落；②睾丸网及附睾的自身免疫过程可造成精子输出的阻断。治疗少、弱精子症，重点应查明病因，在查清病因的基础上，对症治疗。是精索静脉曲张引起的则要及时手术治疗，如果是生殖器官炎症则要积极消除炎症，如果是缺乏某种营养物质，则要及时补充，如果是内分泌因素所引起则要行内分泌治疗，总之，只有查清了病因，对症治疗才有可能治愈少、弱精子症。对于少、弱精子症，中医认为主要是肾肝脾功能失调造成的。肾藏精，主生殖，肾虚则生精功能障碍，可能出现阳萎、不射精、少精、弱精、死精。肾藏精，肝藏血，肝肾同源，精血互生，肝经络阴器，肝阴亏损则精少，肝经湿热则伤精而无子。所以治疗上应辨证施治，随症加减，标本兼治，攻补兼施。目前检测少精症的方法也有。比如CN101633925A公开了一种与精子生成障碍相关的精浆微小核糖核酸标志物及其应用。该标志物选自SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4中一种或多种。该标志物对精子生成障碍具有特异性和敏感性，可用于制备精子生成障碍诊断或监测的试剂，可避免侵入性诊断，可反复检测，且易于动态监测精子生成障碍的程度。CN106148524A提供了一种研究人体无精症和严重少精症快速测试的方法，包括：样品收集，样品处理及利用real-timePCR平台诊断和利用样品处理的结果进行ELISA检测。但是基于该疾病的检测准确度以及检测方法更优化的需要，本领域急需进一步开发检测少精症的方法、试剂盒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测CRKL所在的突变位点多态性的试剂盒，用以检测样本是否为少精症患者。本专利技术的试剂盒利用普通PCR技术，包含：人外周血基因组提取试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液，还包含基因突变扩增引物。本专利技术提供含有所述突变位点的CRKL基因片段，其序列如下：(R为t/c突变)本专利技术提供上游扩增引物序列为：5'-ctctggaaattcgttaatgt-3'；下游扩增引物序列为：5’-gtccacaagggagagcagac-3’内部参照基因上游扩增引物：5，-TTATCGCATACGGCTAGGC-3，内部参照基因下游扩增引物：5，-CACAATTCCCACCACGAGA-3。其中的人外周血基因组提取试剂为：去离子水，6MNaI，氯仿/异戊醇(24：1v/V)混合液，异丙醇和无水乙醇。其中阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以已知患者的外周血基因组DNA为阳性对照。其中的PCR反应液包括：10XPCR混合液、O.25pmol/μL的引物、的MgCl2,2U的Taq酶、的dNTPs、dUTP、通常取的模板。本专利技术提供的一个技术方案是：一种用于检测少精子症的试剂盒,其含有能够检测与少精症相关的分子标记的检测试剂。优选地，所述与少精症相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其与正常的基因相比，区别在于：在SEQIDNO：1第81位存在一个单核苷酸多态性：t>c。优选地，所述检测试剂为如下引物，序列如序列表中SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。本专利技术提供的一个技术方案是：SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的引物对在用于检测少精症中的应用。优选地，所述试剂盒中，除引物外，还包括有PCR反应液，PCR反应液由dNTP、Mg2+、Taq酶和Buffer组成。本专利技术提供的一个技术方案是：一种体外检测样品是否存在少精症基因的单核苷酸多态性的方法，步骤如下：(1)用特异性引物扩增样品，得到扩增产物；所述引物为一对，具有SEQIDNO：2和SEQIDNO：3的序列；(2)对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：在SEQIDNO：1第81位存在一个单核苷酸多态性：t>c。本专利技术提供的一个技术方案是：一种分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其与正常的基因相比，区别在于：在SEQIDNO：1第81位存在一个单核苷酸多态性：t>c。用本专利技术的试剂盒检测临床待检者外周血CRKL基因片段基因多态性，预测少精症患者情况：首先使用外周血基因组DNA提取试剂得到患者外周血基因组DNA，利用合成的PCR引物进行PCR扩增。扩增产物直接采用DNA凝胶电泳，通过测序，即可判断基因突变与否，从而判断检测源是否为少精症患者。克服了现有技术的少精症检测还要取精子的麻烦，以及其他检测方法的冗余复杂状况。该试剂盒操作简便、检测过程短、经济有效，便于临床医生有针对性的制定治疗方案，有很高的临床应用价值，特别适合临床推广。本专利技术试剂盒的优点和有益效果为利用设计的特定性引物，采用PCR技术，因此它的检测灵敏度很高。具有很高的准确性，特异性好、假阳性低。操作简单、安全、自动化程度高、防污染。速度快、高通量，可在2-3小时完成。经济、便捷，便于临床广泛开展，节省患者开支，能够批量化检测。具体实施方式下面通过具体实例对本专利技术进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例1CRKL基因突变的检测及与少精症的关联分析1.1研究对象选取少精症患者100例，2012年7月～2017年12月于苏州大学附属第一医院确诊治疗，临床资料从病历获得。年龄相似的对照50例，为体检中心体检健康人群。取受试人员外周血1.5ml，于-80℃冷藏保存。所有受试人员均按照苏州大学附属第一医院伦理委员会要求征得同意。1.2DNA提取用常规酚氯仿法提取受试者外周血DNA，具体如下：1)取1ml外周血，3-6℃1600g离心8-12min，将上清液于:4℃16000g离心8-12min后再取上清液；2)取步骤1)中经16000g离心得到的上清液于离心管中，加等体积消本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测少精子症的试剂盒,其特征在于：其含有能够检测与少精症相关的分子标记的检测试剂。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测少精子症的试剂盒,其特征在于：其含有能够检测与少精症相关的分子标记的检测试剂。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述与少精症相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其与正常的基因相比，区别在于：在SEQIDNO：1第81位存在一个单核苷酸多态性：t>c。3.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为如下引物，序列如序列表中SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。4.SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的引物对在用于检测少精症中的应用。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，除引物外...

【专利技术属性】
技术研发人员：王振，张勇，
申请(专利权)人：苏州立豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32