本发明专利技术提供了一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物及试剂盒和应用。该miRNA标记物为hsa‑miR‑302e，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；该miRNA标记物的引物的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。将miRNA标志物及其引物用于制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒。本发明专利技术的miRNA标记物能够用于判断免疫性血小板减少症的进程和严重程度；在其基础上开发的hsa‑miR‑302e引物及诊断试剂盒和检测方法操作简便，对受检者的创伤性小，且灵敏度高，特异性强，可用于早期和不同阶段免疫性血小板减少症的诊断，具有明显的临床应用价值。
MicroRNAs Markers and Kits for Immune Thrombocytopenia and Their Application
The invention provides a microRNA marker and a kit and application of immune thrombocytopenia. The microRNA marker is HSA microRNA 302 e, and its base sequence is shown as SEQ ID NO: 1. The primer base sequence of the microRNA marker is shown as SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. MicroRNA markers and their primers were used to prepare drugs to inhibit immune thrombocytopenia or kits for assistant diagnosis of immune thrombocytopenia. The microRNA marker of the present invention can be used to judge the course and severity of immune thrombocytopenia; the HSA Mi 302 e primer and diagnostic kit and detection method developed on the basis of the microRNA marker are simple to operate, less invasive to the subjects, high sensitivity and specificity, and can be used for the diagnosis of immune thrombocytopenia in early and different stages, with obvious clinical response. Use value.
【技术实现步骤摘要】
免疫性血小板减少症的miRNA标志物及试剂盒和应用
本专利技术属于医学检验
，尤其涉及一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物及试剂盒和应用。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是存在于体内的一种长度大约为19-23nt的微小非编码RNA，通过碱基配对原则与靶基因mRNA5’-UTR或者3’-UTR中的互补序列结合，使mRNA降解或者抑制相关蛋白质的翻译，从而在转录后水平对基因的表达进行调控，一个microRNA可能结合多个mRNA，一个mRNA也可能被多个microRNA所调节。生物机体内约有1/3的基因受miRNA的调控。然而，ITP患者中具体有哪些miRNA表达异常目前还存在争议，miRNA在ITP的发生发展中的具体作用机制至今还未阐明。原发性免疫性血小板减少症(primaryimmunethrombocytopenia,ITP)是一种获得性自身免疫性疾病。其特点为血小板生成减少及破坏增加，临床以皮肤黏膜出血为主，严重者可有内脏出血，出血风险随年龄而增加。ITP的病因十分复杂，涉及包括遗传、感染、免疫功能异常等在内的众多因素，目前普遍认为以免疫学发病机制为主，患者体内产生针对血小板特异性糖蛋白GPIIb-IIIa和GPIb-IX的自身抗体，进而引发单核/巨噬细胞Fc受体介导的血小板清除，导致血小板数量降低。ITP治疗上多为对症治疗，疾病进展可产生脊髓或颅内出血，严重影响患者生活质量，也带来沉重的经济负担。在中国，儿童ITP的年发病率约为46/100万人口，成人为38/100万人口。ITP急性期一般六个月内自愈，但有20％-30％可发展为病程持续超过12个月、治疗较为棘手的慢性ITP和难治性ITP。miRNA是调节基因表达的内源性非编码RNA，在转录后水平对基因表达进行调控，参与细胞周期、凋亡、分化和新陈代谢等生理过程。miRNA在细胞中表达失调会导致免疫性血小板减少症等多种疾病的发生，最新研究表明，一些miRNA在免疫性血小板减少症患者外周血异常表达，但何种miRNA与免疫性血小板减少症的发生、发展有关仍未达成共识。因此有必要寻找与免疫性血小板减少症发生、发展有关的miRNA，从而为临床上判断和治疗免疫性血小板减少症提供一种有效手段。
技术实现思路
基于现有技术免疫性血小板减少症检测与治疗中所存在的问题，本专利技术的第一目的在于提供一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物；本专利技术的第二目的在于提供一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物的引物；本专利技术的第三目的在于提供miRNA标志物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用；本专利技术的第四目的在于提供miRNA标志物的引物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用；本专利技术的第五目的在于提供一种免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒；本专利技术的第六目的在于提供一种检测免疫性血小板减少症的miRNA标志物的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案得以实现：一方面，本专利技术提供一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物，该miRNA标记物为hsa-miR-302e，其碱基序列为UAAGUGCUUCCAUGCUU(如SEQIDNO：1所示)。该hsa-miR-302e为hsa-miR-302e的初始miRNA在人细胞内被剪切并表达为的成熟hsa-miR-302e。另一方面，一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物的引物，该miRNA标记物的引物的碱基序列为：引物F的序列(5'-3')为：GGGTAAGTGCTTCC(如SEQIDNO：2所示)引物R的序列(5'-3')为：CAGTGCGTGTCGTGGAGT(如SEQIDNO：3所示)。再一方面，本专利技术提供上述miRNA标志物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。再一方面，本专利技术提供上述miRNA标志物的引物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。再一方面，本专利技术提供一种免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血中hsa-miR-302e的表达水平。上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒含有免疫性血小板减少症的miRNA标志物；所述miRNA标志物的碱基序列如SEQIDNO：1所示。上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒含有miRNA标志物的引物，所述引物的碱基序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒还包括总RNA提取常用试剂、cDNA反转录引物、反转录常用试剂、荧光定量Q-PCR反应常用的聚合酶及试剂和荧光检测试剂。上述的试剂盒中，优选地，所述cDNA反转录的引物序列为：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAAGCAT(如SEQIDNO：4所示)。上述的试剂盒中，优选地，所述试剂盒还包括标准品和/或对照品。上述的试剂盒中，优选地，所述标准品和/或对照品为内源性miRNA-U6RNA。再一方面，本专利技术还提供一种检测免疫性血小板减少症的miRNA标志物的方法，包括以下步骤：步骤一，分离纯化外周血，抽提血液样本中的总RNA；步骤二，将总RNA反转录为cDNA；步骤三，通过荧光定量Q-PCR对cDNA和参照基因进行扩增检测has-miR-302e的表达水平；步骤四，进行统计分析评估。上述的方法中，优选地，所述反转录采用的引物序列如SEQIDNO：4所示。上述的方法中，优选地，所述荧光定量Q-PCR采用的引物序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。上述的方法中，优选地，所述参照基因为内源性miRNA-U6RNA。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术首次发现外周血miRNA标志物hsa-miR-302e在免疫性血小板减少症中明显升高，并且不同分期表达不同，且表达水平与患者血小板呈显著负相关；对ITP不同时间(初诊期+持续期、慢性期+难治期)的诊断具有很高的诊断价值和显著的统计学意义，能够用于判断免疫性血小板减少症的进程和严重程度；为免疫性血小板减少症免疫治疗提供了新的药物靶点。(2)本专利技术在miRNA标志物hsa-miR-302e基础上开发的hsa-miR-302e引物及诊断试剂盒和检测方法，其操作简便，对受检者的创伤性小，且灵敏度高，特异性强，可用于早期和不同阶段免疫性血小板减少症的诊断，具有明显的临床应用价值。(3)本专利技术的检测方法采用的是内源性miRNA-U6RNA作为参照基因，避免了由于疾病个体间差异造成的数据偏差，显著提高了检测结果的稳定性。附图说明图1为本专利技术实施例1中免疫性血小板减少症病例组和中健康对照组外周血hsa-miR-302e的表达水平示意图；图2为本专利技术实施例1中ITP患者不同分期(初诊断+持续期、慢性期+难治期)外周血hsa-miR-302e的表达水平示意图；图3为本专利技术实施例1中检测样本中hsa-miR-302e水平与血小板水平的相关性分析示意图；图4为本专利技术实施例3中has-miR-302e水平对ITP的诊断价值的ROC曲线图；图5为本专利技术实施例4中外周血水平hsa-miR-302e水平对ITP患者初诊断+持续期的预测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物，其特征在于：该miRNA标记物为hsa‑miR‑302e，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物，其特征在于：该miRNA标记物为hsa-miR-302e，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。2.一种免疫性血小板减少症的miRNA标志物的引物，其特征在于：该miRNA标记物的引物的碱基序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。3.权利要求1所述miRNA标志物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。4.权利要求2所述miRNA标志物的引物在制备抑制免疫性血小板减少症的药物或制备免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒中的应用。5.一种免疫性血小板减少症辅助诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒用于检测外周血中hsa-miR-302e的表达水平。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有免疫性血小板减少症的miRNA标志物；所述miRNA标志物的碱基序列如SEQIDNO：1所示。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有miRNA标志物的引物，所述引物的碱基序列如SEQIDN...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱琤，吴天勤，任传路，邓安梅，严文颖，沈红石，李征洋，
申请(专利权)人：中国人民解放军第一零零医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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